融水小型豬剖檢程序以及主要臟器自發性病變組織學觀察

施赫赫，孫 俠，劉 科，任海濤，陳 淦，黃 威，鐘志勇，劉運忠，林秋雄，唐小江

(1．廣東省醫學實驗動物中心，廣東佛山 528248;2．廣東貝格生物科技有限公司，廣東佛山 510642;3．廣州醫藥工業研究總院，廣州 510240;4．廣東省醫學科學院，廣州 510060)

豬在解剖學、生理學、疾病發生機制等方面與人極其相似，小型豬作為實驗動物應用十分廣泛，包括腫瘤、心血管病、糖尿病、外科、牙科、皮膚燒傷、血液病、遺傳病、營養代謝病和新藥評價等多個方面［1］。小型豬因體型小，便于實驗研究，許多個國家的研究機構對小型豬已經進行深入研究和應用。臟器解剖學和組織學數據是衡量動物遺傳品質的重要生物學特性，在遺傳品質鑒定、衡量和動物功能狀態以及藥物、生物制品非臨床安全性評價中起到重要的作用［2］，這些指標的測定及評價對小型豬的研究應用具有重要意義和價值。融水小型豬(rongshui miniature pig，RMP)是一種體型小、性情溫馴的小黑豬。2009年本課題組在廣西壯族自治區融水縣桿洞村苗寨發現并將該品種引種到廣東佛山三水樂平鎮的小型豬基地進行實驗動物化研究。該豬種缺少科學、系統的觀測數據，測定和分析各種生物學數據是融水小型豬實驗動物化的基礎。為此，我們初步對F1代融水小型豬進行了主要器官解剖學和組織學觀察，制作組織切片進行觀察拍照，同時測定了全身血量及血漿量、記錄脊椎數量和恒齒齒式。

1 材料和方法

1.1 動物來源

6月齡普通級融水小型豬4頭，雌雄各半，由廣東貝格生物科技有限公司(廣東省醫學實驗動物中心小型豬研發基地)提供。實驗動物及實驗操作經過廣東省醫學實驗動物中心倫理委員會批準。

1.2 動物飼養條件

飼養環境為普通級，濕簾通風系統和局部保溫燈控制舍內溫濕度，夏天溫度可控制在28℃ ～30℃，冬天溫度可控制在16℃ ～20℃;每天定時定量飼喂全價顆粒料，上下午各一次;自由飲水。

1.3 主要儀器及試劑

1.3.1 主要儀器:輪轉切片機(德國LEICA公司RM2135)，生物組織全自動脫水機(湖北孝感醫用儀器有限公司TS-12C)，生物組織包埋機及冷凍機(湖北孝感醫用儀器有限公司 BM-VII)，攤片烤片機(湖北孝感醫用儀器有限公司 CS-VI)，生物組織全自動染色機(湖北孝感醫用儀器有限公司 RS-18)，病理圖像分析系統(日本奧林巴斯BX41)。

1.3.2 主要試劑:福爾馬林、石蠟、二甲苯、酒精、伊紅、蘇木素、中性樹膠。

1.4 方法

1.4.1 解剖、組織學檢查項目

心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、腦、脊髓、胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸、睪丸、附睪、前列腺、精囊腺、子宮、卵巢、胸腺、胰腺、淋巴結、肌肉、坐骨神經、甲狀腺、膀胱、膽囊。

1.4.2 解剖

解剖前禁食12 h，麻醉后頸動脈放血，處死后立即分離主要臟器，剔除臟器表面的脂肪和筋膜，用濾紙吸凈表面的血液，使用電子天平稱量實質器官重量，并用NICON D4000單反相機拍照。軟尺測量大小腸長度并記錄頸椎、胸椎、腰椎、骶椎、尾椎、乳頭數量及齒式。

1.4.3 制片

組織標本經取材、固定、修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后，石蠟切片，HE染色、封片;

1.4.4 讀片

將制作好的HE染色切片置于顯微鏡下，從低倍到高倍觀察組織有無病理變化，并用奧林巴斯BX41顯微鏡拍照。

2 結果(彩圖見彩插1－7)

2.1 大體解剖流程及解剖圖

對4頭融水小型豬進行大體解剖，過程如下:沿氣管旁剪開皮膚，鈍性分離皮下結締組織和肌肉，找到頸動脈鈍性分離，使用血管夾夾住近心端，在遠心端作一斜面切口插入導管并用棉線扎緊，放開血管夾放血用于測定全身血量和血漿量。切開腹部中部縱向皮膚，在腹白線處分離皮下結締組織，肌肉與腹膜;暴露腹腔取出各個器官并稱重拍照;分離胸骨暴露胸腔，取出器官稱重拍照。切開頭顱皮膚，分離皮下結締組織與肌肉;鋸開顱骨暴露腦組織并取出稱重拍照。取完各臟器后，分別分離出后腿側的坐骨神經;分離出脊椎，記錄各段數量;觀察恒齒，并記錄數量。大體解剖見圖1。

2.2 臟器重量、臟器系數、脊椎數量及恒齒齒式

對4頭融水小型豬測定了臟器重量及臟器系數，記錄了脊椎數量等數據。臟器重量及臟器系數見表1，數據以平均數(ˉx)和標準差(SD)表示，未進行統計分析。從表1可知，雄性體重小于雌性，除了腎上腺平均重量相同外，其各主要臟器平均重量都是雄性小于雌性。臟器系數除了胸腺的臟器系數是雄性大于雌性外，其他主要臟器系數均是雄性小于雌性。脊椎個數等其他基礎數據(表2)。

表1 融水小型豬體重、臟器重量和臟器系數的測定結果Tab．1 The body weight，organ weight and organ coefficient in Rongshui miniature pigs

表2 融水小型豬脊椎個數、腸長度等基礎數據Tab．2 The basic data such as number of vertebration and length of intestine in Rongshui miniature pigs

2.3 主要臟器觀察與組織學檢查

對融水小型豬臟器組織進行了臟器觀察，拍照，各臟器組織外觀未見明顯病理異常，臟器組織(圖2)。并對各組織器官進行了病理切片，各組織檢查結果如下:

心臟:心肌纖維束排列整齊，未見萎縮、肥大、空泡變性、壞死，未見心肌纖維化，間質未見水腫、充血、出血及炎細胞浸潤(圖3-A)。

肝臟:肝小葉結構清晰，肝細胞索狀排列，肝細胞未見變性、壞死，竇內皮細胞及枯否氏細胞未見增生，未見膽管增生、膽汁瘀滯、纖維化及炎細胞浸潤(圖3-B)。

脾臟:紅、白髓結構清晰，動脈周圍淋巴鞘清晰可見，中央動脈未見病變，脾小體分布、形態正常，部分生發中心清晰，脾竇未見出血(圖4-A)。

肺臟:細、小支氣管周淋巴細胞浸潤;肺泡管及肺泡結構清晰，肺泡未見擴張、萎陷，肺泡壁毛細血管未見擴張、充血，肺泡間隔未見增厚，肺泡腔清晰，未見肺水腫和肺出血，肺泡內未見巨噬細胞聚集(圖4-B)。

腎臟:皮、髓結構清晰，腎小球未見明顯增大、萎縮、空泡化、玻璃樣變、硬化，腎小管未見萎縮、肥大、增生、再生、空泡化、嗜堿性變、色素沉著、凝固性壞死，腎小管管腔未見擴張，未見透明管型、礦物質沉積，間質未見炎細胞浸潤、纖維組織增生，腎乳頭未見壞死，腎盂未見擴張積水及炎細胞浸潤(圖5-A)。

腎上腺:皮、髓質結構清晰，皮質球狀帶、束狀帶、網狀帶細胞排列及形態正常，髓質細胞形態及分布正常，各區細胞未見增生、萎縮，未見出血、壞死及炎癥反應(圖5-B)。

大腦:大腦皮質各層神經元、神經膠質細胞形態正常，未見萎縮、變性、壞死、增生等改變，間質未見水腫、充血、出血，未見炎癥細胞浸潤及血管浸潤套形成。白質未見脫髓鞘，室管膜及脈絡膜未見異常，未見腦室積水(圖6-A)。

小腦:皮質中浦肯野細胞及各種神經元細胞形態正常，各層組織結構清晰，腦膜未見充血，蛛網膜下腔未見水腫及滲出物，小腦組織神經元未見腫脹，胞漿未見空泡形成，未見核偏位;未見神經細胞壞死、膠質細胞增生，未見軟化灶形成;腦組織間質未見水腫、血管擴張充血、瘀血及炎癥細胞浸潤，白質未見脫髓鞘(圖6-B)。

腦干:腦干各神經核團形態清晰、正常，神經元細胞較大、神經突起明顯，神經核大、核仁清晰。神經纖維束分布正常。腦干內未見出血、壞死灶(圖6-C)。

脊髓:白質和灰質結構完整，灰質呈H型，脊髓灰質前角運動神經元細胞形態排列正常，未見變性、壞死表現，脊髓側角和后角神經元及中央管結構亦正常，未見神經細胞壞死及嗜神經細胞現象;未見血管擴張充血、出血;白質有髓神經纖維結構清晰、未見脫髓鞘(圖7-A)。

胃:粘膜上皮完整，腺體排列整齊，未見糜爛、出血、壞死或潰瘍形成。胃壁細胞及主細胞形態正常，未見萎縮、變性或壞死，未見化生或異型增生。肌層未見肥厚、萎縮或出血、壞死。漿膜未見充血、水腫及炎癥細胞滲出(圖8A)。

十二指腸:粘膜上皮組織部分自溶，考慮未及時固定(圖8-B)。

空腸:粘膜上皮組織部分自溶，考慮未及時固定(圖9-A。)

回腸:絨毛間質充血、少量炎細胞浸潤(圖9-C)。

結腸:粘膜層見粘膜相關淋巴組織(圖9-B)。

睪丸:生精小管結構清晰，各級生精細胞形態正常，精子細胞清晰可見，支持細胞未見異常，未見曲細精管萎縮、多核巨細胞生成改變;間質細胞未見增生;間質未見水腫、充血、出血及炎癥細胞浸潤(圖10-A)。

附睪:附睪管上皮細胞未見空泡化，管腔內可見大量精子，未見精子肉芽腫，間質未見水腫、充血、出血及炎細胞浸潤(圖10-B)。

前列腺:腺體松散分布，腺腔內可見分泌物，間質疏松、量少，未見腺上皮增生、間質纖維組織增生、間質充血、水腫、炎細胞浸潤等病理改變(圖10-C)。

子宮:子宮壁各層結構清晰，子宮內膜粘膜上皮呈單層柱狀排列，粘膜下固有膜結締組織內有子宮腺，子宮肌層和子宮外膜未見明顯病理異常(圖11-B)。

卵巢:各級卵泡、黃體，數量正常，未見濾泡囊腫、血腫及腫物形成(圖11-A)。

胸腺:胸腺皮、髓質形態正常，分界清晰，皮質未見萎縮，皮質淋巴細胞形態及分布正常，髓質細胞形態及分布未見異常(圖12-B)。

胰腺:胰腺組織結構未見異常，可見外分泌部和胰島，胰島細胞排列正常，外分泌部腺泡上皮細胞未見細胞萎縮、變性、壞死，未見炎細胞浸潤(圖14-B)。

淋巴結:皮質區淋巴小結形態正常，帽區、明區和暗區清晰可見，副皮質區淋巴細胞形態及分布正常，髓竇及被膜下淋巴竇形態未見異常(圖13-B)。

甲狀腺:甲狀腺組織結構未見異常，甲狀腺濾泡結構正常，濾泡上皮細胞未見變性、壞死，濾泡旁細胞未見增生，未見炎癥細胞浸潤(圖12-A)。

膀胱:粘膜(變移上皮)由三層至數層移行上皮細胞組成，結構完整，上皮細胞未見變性、壞死、脫落，固有膜內膠原纖維、彈力纖維未見變性、增生等改變，肌層內平滑肌纖維形態排列正常，各層組織中未見炎細胞浸潤(圖13-B)。

膽囊:粘膜固有層見炎細胞浸潤(圖14-A)。

皮膚:表皮結構完整，真皮層的膠原纖維、皮膚附件結構清晰，未見壞死、水腫、充血、出血及炎細胞浸潤(圖15-A)。

肌肉:肌漿紅染，橫紋清晰，細胞核位于肌纖維周邊部。未見肌纖維凝固性壞死，間質水腫、充血、出血及炎細胞浸潤(圖15-B)。

坐骨神經:神經纖維平行排列，未見神經纖維變性及脫髓鞘(圖7-B)。

3 討論

本研究對融水小型豬的29個器官進行外觀和組織切片觀察及拍照，保存了大體解剖和組織學的資料，充實了融水小型豬的生物學數據。各臟器組織外觀未見明顯病理異常，僅肺顏色有點暗紅;組織學檢查中發現，肺臟細小支氣管周淋巴細胞浸潤，其他器官均為正常，未發現病理性變化。

將融水小型豬的組織切片結果與《西藏小型豬組織胚胎學研究》［3］和《貴州小型豬組織學圖譜》［4］進行比對，骨骼肌橫斷面組織切片的比較中，融水小型豬的骨骼肌肌束之間結締組織和肌間脂肪比西藏小型豬與貴州小型豬少，骨骼肌更致密，這與大體解剖觀察到的一致。

豬淋巴結的組織結構并不完全與人類的相同，皮質和髓質可以分別出現于外周區域和中央區域，西藏小型豬淋巴結皮質和髓質交替存在［3］。但貴州小型豬的髓質成分分布在外周，皮質則位于淋巴結的中央部分［4］。從融水小型豬淋巴結組織切片來看，其皮質區同樣可以出現在外周區域，而髓質分布于中央區域，說明融水小型豬與西藏小型豬在淋巴結結構上與人更加接近。

實驗動物的自發性病變存在于普通級、SPF級動物，如大鼠、比格犬、食蟹猴、樹鼩等都有相關報導［5－10］。引起自發性病變的因素很多，如遺傳、營養、用藥、中毒及環境因素等，也包括原因未明的傳染因子［8］。有的還與年齡增長相關［11－12］。徐永華等［13］的研究認為，人類和其他動物在支氣管、小支氣管周圍有不同程度炎細胞浸潤，而且肺內塵細胞較多，是與生存環境空氣受污染有關。西藏小型豬由于長期生存在很少受污染的高原寒冷環境，呼吸系統是清潔的。同樣地，由于融水小型豬在普通級環境下飼養，而呼吸系統各器官屬于管腔器官，容易與空氣中物理性、化學性物質如粉塵、氨氣等接觸，刺激引起小支氣管、細支氣管的病理變化。另外，小支氣管、細支氣管黏膜細胞浸潤，存在病原體影響的可能性。在融水小型豬的肺臟組織切片中，只發現小支氣管、細支氣管周圍淋巴細胞浸潤，肺內未發現塵細胞，其他結構未發現病理性變化，這也說明了飼養環境中的刺激因素比較小，或者病原體對肺臟的影響較小。

本研究使用的融水小型豬總體健康狀況良好，其組織器官外觀正常，組織切片檢查基本正常，可以作為融水小型豬病理性檢查的正常組織切片參考依據。同時，從本次研究的結果也可以從側面反映出，在融水小型豬飼養管理過程中，較好的控制了環境、飼料和微生物等環節。融水小型豬在醫學實驗相關方面是一種具有潛力的實驗動物。由于實驗動物的自發性病變會影響動物質量和干擾動物實驗結果，提示在融水小型豬的整個飼養管理過程中，必須嚴格執行各方面質量控制體系，盡量減少外部誘因對融水小型豬自發性病變的影響。

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