雙丹明目膠囊對糖尿病視網膜病變大鼠視網膜VEGF和VEGFR蛋白表達的影響

秦裕輝，李文娟，張 熙，戴宗順，陳曉柳，周亞莎，凌艷君，鄭 兵

（1.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙410006；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208）

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)性微血管病變中最重要的表現，是糖尿病的嚴重并發癥之一。 DR 發病率隨DM 病程的發展而增高，5年內DR 的發生率為44.4%，7年后為56%[1]。 DR 的特點主要為視網膜微血管進行性損害，血管通透性增加，新生血管形成，導致視力喪失。 DR 的發生、發展與多種生長因子和細胞因子有關，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、 堿性成纖維細胞生長因子、腫瘤壞死因子、C 反應蛋白等[2]，其中VEGF是貫穿糖尿病視網膜病變發生、發展過程中最重要的因子[3]。

糖尿病視網膜病變中醫稱為“消渴內障”，基于中醫“滋腎活血”的原則，我們研制了雙丹明目膠囊（原名：降糖明目膠囊），并在2009年對雙丹明目膠囊進行多中心臨床試驗，取得了良好的療效[4]。 前期研究發現雙丹明目膠囊能降低鏈脲佐菌素糖尿病大鼠模型血清VEGF 水平，降低眼組織VEGF 基因表達水平[5]。 本實驗以VEGF 及其受體為中心，探討雙丹明目膠囊治療糖尿病視網膜病變的作用機制，現將實驗方法和結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8 周齡健康， 無眼部疾患SD 大鼠40只（北京維通利華實驗動物有限公司提供，SPF 級，遠交系），體質量（200±50）g。 動物使用許可證號：SYXK（湘）2009-0001，質量合格證編號：11400700027462。飼養于湖南中醫藥大學動物中心， 大鼠自由攝食飲水，實驗前飼養1 周。

1.1.2 主要藥品 雙丹明目膠囊： 北京岐黃制藥有限公司， 批號：Z20080062； 羥苯磺酸鈣 （Calcium dobesilate)，商品名“昊暢”：寧夏康亞藥業有限公司，250 mg/粒，批號：1131115；重組人血管內皮抑制素注射液，商品名“恩度”：煙臺麥得津生物工程股份有限公司，15 mg/（3 mL·支），批號：201307018。

1.1.3 主要試劑 鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）， 十二烷基硫酸鈉 （Sodium dodecyl sulfate，SDS）：Sigma 公司；Anti-VEGF、Anti-VEGFR1、Antibeta-actin：北京博奧森生物技術有限公司;HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG： 北京康為世紀生物科技有限公司；RIPA 裂解液：北京普利萊基因技術有限公司； 蛋白酶抑制劑：Merck 集團；蛋白磷酸酶抑制劑： 瑞士Roche 制藥公司； 一抗[VEGF 磷酸化單克隆抗體（ab1316）、VEGFR 磷酸化單克隆抗體 （Sc-9029）]：Santa cruz Biotechnology；二抗[辣根過氧化物酶（HRP）二抗（2B-2301）]：北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器 ONETOUCH Select Simpie 強生血糖儀：強生（中國）醫療器材有限公司；TS-92 搖床： 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；TGL-18R 臺式冷凍離心機： 德國Eppendorf 公司；164-5050 電泳儀、DYCZ-40A 轉膜儀、DYCZ-24EN 電泳槽均為北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 造模[6-7]將40 只大鼠采用隨機數字表法隨機抽取10 只作為正常組，其余30 只造模。 造模前大鼠禁食10 h，自由飲水。 用STZ 劑量50 mg/kg 一次性大鼠尾靜脈注射的方法造模。 正常組大鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水。72 h 后取尾靜脈血，強生血糖測試儀測血糖， 尿糖試紙定性測尿糖， 空腹血糖濃度>16.7 mmol/L、尿糖在+++以上者，即為DM 大鼠。成模后觀察1 周，穩定者為DM 模型造模成功。

1.2.2 分組及給藥 將造模成功后的30 只大鼠隨機分為模型對照組、雙丹明目組、陽性對照組3 組，每組10 只。 正常組和模型對照組均用生理鹽水灌胃，劑量10 mL/（kg·d），雙丹明目組用雙丹明目膠囊溶液灌胃[8]加蒸餾水玻璃體腔內注射，雙丹明目膠囊成人每日服用量為31.8 g/人，動物給藥劑量按比例換算，劑量為5.6 g/（kg·d），蒸餾水2 mL/眼；陽性對照組用羥苯磺酸鈣溶液（昊暢）灌胃加重組人血管內皮抑制素（恩度）玻璃體腔內注射[2]，昊暢1.0 g/（kg·d），恩度2 mL/眼，造模后第10 天開始玻璃體腔內注射，1 次/10 d。 各組大鼠均自造模成功后連續灌胃8 周，不限飲食，每日更換墊料1 次，按時通風，保持環境安靜。

1.3 標本采集及指標測定

1.3.1 大鼠視網膜血管內皮細胞總蛋白的采集 10%水合氯醛過量麻醉后斷頭法處死動物， 即刻去除球外結締組織，用700 ml/L 乙醇浸泡1 min，PBS 液沖洗后沿角膜緣后4 nm 剪除眼前節， 去除玻璃體和晶狀體， 鈍性分離出完整視網膜組織，D-Hanks 液中展平視網膜，剪除肉眼可見的視網膜大血管分支及部分色素組織，將剩余視網膜組織充分剪碎，200目篩網過濾， 收集網上組織置入15 mL 離心管中，在室溫下加入2%胰蛋白酶消化20 min，1 200 r/min 離心10 min， 棄胰蛋白酶再加入0.1%Ⅰ型膠原酶消化20 min，離心半徑20 cm，1 200 r/min 離心10 min，得到視網膜血管內皮細胞，將該細胞沉淀重懸于含10%特級胎牛血清和5 ng/mL β-ECGF的內皮細胞培養液中， 種植于涂有5 mg/mL 纖維黏連蛋白的培養皿內培養至融合。 細胞融合后，棄去培養液，用磷酸鹽緩沖液清洗3 次，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解后，置于離心機中，以1 200 r/min，在4 ℃溫度下離心30 min，收集各組大鼠視網膜內皮細胞總蛋白。

1.3.2 Western blot 檢 測VEGF 和VEGFR 蛋 白的表達[6]取樣本進行12.5% SDS 聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電泳結束后轉膜。 轉膜完畢后，將膜取出放入TBS-T 中洗3 次，每次3 min。 封閉：配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，置4 ℃過夜。 結合一抗： 用封閉液將一抗1∶400 稀釋， 與膜一起孵育3 h，室溫振蕩。 洗膜：TBS.T 洗3 次，每次5 min。 結合二抗：1∶3 000 稀釋，與膜共同孵育1.5 h。 洗膜，同上。 暗室中在膜上滴加ECL，經適當顯色后，用保險膜將膜包好，將膜放入暗盒中，上置醫用X 光膠片，暴光適當時間，經顯影，定影，室溫下晾干。 圖像掃描，灰度分析。 以VEGF、VEGFR 與β-actin 的光密度比值表示VEGF、VEGFR 蛋白的表達。 實驗重復3 次。 應用圖像分析軟件Image J 進行光密度[IOD]半定量蛋白質檢測。

1.4 統計學分析

所有實驗數據采用SPSS 16.0 系統軟件處理。計量資料實驗數據以“±s”表示，先進行正態性分布及方差齊性檢驗，若滿足正態性和方差齊性，多組比較采用方差分析（LSD 法及Dunnett 法）。 不滿足正態性和方差齊性時， 則用非參多重比較。 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

正常組中有少量VEGF 及VEGFR 表達； 模型對照組VEGF 及VEGFR 的表達量明顯升高， 與正常組相比差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；雙丹明目組和陽性對照組VEGF 及VEGFR 的表達量降低，與模型對照組相比差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；雙丹明目組和陽性對照組間的差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表1 及圖1。

表1 各組大鼠視網膜血管中相對VEGF 蛋白及VEGFR 蛋白表達的比較 （±s，n=10）

表1 各組大鼠視網膜血管中相對VEGF 蛋白及VEGFR 蛋白表達的比較 （±s，n=10）

注：與正常組相比較※※P＜0.01；與模型對照組比較▲▲P＜0.01。

組 別正常組模型對照組雙丹明目組陽性對照組藥物劑量（g/kg·d）— —5.6 1.0 VEGF IOD 值0.127±0.025 0.347±0.031※※0.250±0.026▲▲0.213±0.012▲▲VEGFR IOD 值0.090±0.000 0.450±0.026※※0.197±0.050▲▲0.220±0.017▲▲

圖2 各組大鼠視網膜血管中VEGF 及VEGFR 蛋白電泳圖

3 討論

DR 的發病機制目前尚不清楚， 通常為綜合因素所致。 現有的研究表明DR 是一個多基因多步驟的疾病，其病理改變涉及到了代謝酶、炎癥、細胞周期、信號傳導、胞外基質及離子通道等相關基因的變化[9]。VEGF 是DR 過程中重要的因子，如果VEGF過度表達會導致血-視網膜屏障結構損傷， 促進視網膜血管新生。

在中醫理論上，DR 名為“消渴內障”，根據患眼視覺變化及視力下降情況，將其納入不同的病癥中，如“視瞻昏渺”、“云霧移睛”、“血灌瞳神”、“暴盲”等。對本病各方面的科學研究發現“血瘀”在其發病機制中具有重要作用，認為病因病機為腎虛是根、陰虛為本、血瘀為標，概言之“腎虛血瘀”為其主要病機。 因此，認為DR 的治療應該以“滋腎活血”為基本法則。基于這一法則，項目組研制了雙丹明目膠囊，該藥由女貞子、旱蓮草、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、牡丹皮、丹參、三七、菝葜、牛膝11 味藥物組成，方中女貞子、旱蓮草滋補肝腎為君藥；山茱萸、山藥補腎養肝、健脾固精，丹參、三七養血活血、化瘀通絡共為臣藥；牡丹皮、澤瀉、茯苓、菝葜清肝瀉火、除濕利水為佐藥；牛膝活血逐瘀、 強筋壯骨且性善下行， 可防血氣上逆，為使藥。 諸藥合用共奏益腎養肝、活血明目之功，主治肝腎陰虛、瘀血阻絡所致的DR。

本實驗結果顯示：與正常組相比，模型對照組VEGF 和VEGFR 蛋白表達升高 （P＜0.01）， 表明VEGF 及其受體參與了DR 的發生發展， 可能有助于評價視網膜病變的程度； 與模型對照組比較，雙丹明目組和陽性對照組大鼠視網膜血管中VEGF和VEGFR 蛋白表達均明顯降低（P＜0.01），雙丹明目組和陽性對照組之間無顯著性差異 （P＞0.05），說明雙丹明目膠囊可減輕STZ 性DM 大鼠視網膜血管病理改變， 其可能機制是通過下調視網膜內VEGF、VEGFR 蛋白磷酸化水平，干預VEGF-VEGFR 信號轉導通路。 因此認為雙丹明目膠囊可通過降低VEGF 及其受體水平，從而抑制視網膜新生血管的形成，延緩DR 病情的發展。

[1]MaIone JI，Morrison AD，Pavan PR，et a1. Prevalence and significance of retinopatIly in subjects with Type l diabetes of less than 5 years’duration screened for the diabetes control and complications trial [J]. Diabetes Care，2001，24(3)：522.

[2]徐寒松，孔德明，向 慧.通脈糖眼明膠囊對單純型糖尿病視網膜病變患者VEGF 水平的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志，2011，17(12)：229-231.

[3]段惠惠，黃建梅，于素云，等.STZ 糖尿病大鼠視網膜病變模型的再評價[J].中國比較醫學雜志，2013，23(5)：12-18.

[4]秦裕輝，李 芳，涂良鈺，等.雙丹明目膠囊治療糖尿病視網膜病變的多中心臨床研究[J].湖南中醫藥大學學報，2010，30(1)：46-51.

[5]秦裕輝，孫兆泉.降糖明目膠囊對實驗性糖尿病模型血糖影響的實驗研究[J].中國中醫院科技，2001，8（4）：232.

[6]沈亞非，徐淼成.鏈脲佐菌素誘導實驗性糖尿病大鼠模型建立的研究[J].實用診斷與治療雜志，2005，19(2)：79-80.

[7]李小璐， 馬雅玲. 糖尿病視網膜病變大鼠視網膜VEGF 和PEDF的動態表達[J].眼科新進展，2013，33（9）：816-821.

[8]秦裕輝，孫兆泉.降糖明目膠囊對糖尿病大鼠血液流變性的影響[J].湖南中醫雜志，2000，16(6)：56-57.

[9]謝明捷，呂紅彬，何 躍，等.炎癥因子與糖尿病視網膜病變相關性研究進展[J].眼科新進展，2012，32(10)：990-993.