瓊玉膏酸奶對實驗性衰老模型小鼠抗氧化作用的研究

劉 娟，蔣俊和*，肖作為，袁 悅，齊雪潔，莫倩云

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208）

衰老是生命體生長發育成熟后必經的自然過程，是人類不可抗拒的，但抗衰延年的目標卻是可以實現的。 當今社會，隨著經濟的發展和生活水平日益提高，人口老齡化的問題日顯突出，努力探索和積極尋找延緩衰老的理想方法，已成為醫學界亟待解決的重要課題。 運用藥膳食療方法是中醫抗衰老的特色之一，近年來，抗衰老藥膳產品的研發備受人們關注。 瓊玉膏由人參、生地黃、白茯苓、白蜜組成，有滋陰潤肺、健脾補腎、益壽延年等作用。 酸奶由乳或再制乳經微生物發酵而成，含有SOD 等抗氧化物質，可清除自由基，阻止老化的發生。 因此，酸奶制品作為抗衰老食品具有明顯的優勢和廣闊的市場。 本課題組對研制的瓊玉膏酸奶的抗氧化效應進行動物實驗研究，旨在為瓊玉膏酸奶的開發和應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

昆明種健康小鼠（2～3月齡），50 只，雌雄各半，體質量為（20±2）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（湘）2013-0004， 湖南中醫藥大學動物實驗中心使用許可證號：SYXK（湘）2013-0005。

1.2 藥物和試劑

D-半乳糖（美國Sigma 公司，規格10 g）；0.9%生理鹽水（湖南中醫藥大學第一附屬醫院）；瓊玉膏（1 mL 含生藥1.0 g）、 瓊玉膏酸奶 （1 mL 含生藥1.0 g）、普通酸奶（由湖南中醫藥大學食品科學與工程實驗室自制， 于4 ℃保存， 酸奶儲存期不超過14 d）； 考馬斯亮蘭蛋白、SOD、CAT、GSH-Px、MDA測定試劑盒（均購于南京建成生物工程研究所）。

1.3 主要儀器

UV-2600 型紫外可見分光光度儀（上海儀器有限公司)；低溫高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；漩渦震蕩器（寧波新芝科研儀器研究所)；電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司)；內切式組織勻漿機（寧波新芝科研儀器研究所)；光學顯微鏡（Olympus 公司）。

2 方法

2.1 動物分組、造模及干預

將50 只小鼠雌、雄分開，給予標準飼料適應性飼養3 d 后，隨機分成空白對照組、衰老模型組、普通酸奶組、瓊玉膏酸奶組、瓊玉膏組，每組10 只。除空白對照組外的4 組采用D-半乳糖致衰老動物模型法[1]造模，每日上午給予小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖（10 mg/mL，100 mg/kg），空白對照組注射同等體積的0.9%生理鹽水，連續30 d。 在造模的同時，各組給予相應的干預：空白對照組、衰老模型組灌服蒸餾水(25 mL/kg)，普通酸奶組灌服普通酸奶 (25 mL/kg)， 瓊玉膏酸奶組灌服瓊玉膏酸奶(25 mL/kg)，瓊玉膏組灌服瓊玉膏(2.5 g/kg)和蒸餾水(22.5 mL/kg) 。 酸奶的灌胃劑量參照文獻[2]計算。

2.2 標本采集

給藥結束后稱小鼠體質量并記錄，頸椎脫臼處死小鼠后迅速取出大腦、肝臟、心臟、脾臟，用冰冷的生理鹽水沖洗后，濾紙吸干稱質量。 分別取同側肝、腦組織經10%福爾馬林固定后，用于一般組織病理學觀察。 心臟、另一部分肝臟-80 ℃保存，用于生化指標測定。

2.3 指標測定及方法

2.3.1 一般狀態觀察 觀察各組小鼠一般狀態包括毛色、精神狀態、反應性、活動情況、飲食、二便等方面變化。 記錄各組小鼠藥物干預前、藥物干預7、15、21、30 d 體質量情況。

2.3.2 心、肝、腦、脾指數的計算 根據稱量所得的心、肝、腦、脾的質量及小鼠的體質量，按公式計算臟器指數：

臟器指數=臟器質量(mg)/體質量(g)

2.3.3 肝臟、心肌組織中生化指標的測定 生化指標的測定嚴格按試劑盒說明書操作：蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法，SOD 活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，CAT 活性測定采用可見光法，MDA 含量測定采用TBA 法，GSH-Px 活性測定參照試劑盒說明書。

2.3.4 肝、 腦組織病理形態學檢測 取固定后的肝、腦組織常規石蠟包埋，切片，采用HE 染色法光鏡下觀察肝腦形態學變化，采用尼氏染色法光鏡下觀察海馬神經功能變化。

2.4 統計學分析

數據采用SPSS 19.0 軟件包進行統計學處理，計量資料以“±s”表示，對于滿足正態分布、方差齊性的指標，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD 法檢驗，一組與多組比較采用Dunnett 法； 對于方差不齊的數據用Tamhane's T2法，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠一般情況變化

3.1.1 小鼠一般狀態 實驗開始前，小鼠毛色白而光澤，精神狀態好，反應靈敏，活動自如，飲食、二便色形正常，體質量無差別。 實驗前2 周，所有組小鼠體質量呈增加趨勢。 實驗2 周后造模小鼠毛發卷曲、枯黃、欠光澤、易脫落，精神萎靡，反應不靈敏，行動遲緩，飲食量減少。 實驗終末，空白對照組小鼠狀態如前； 衰老模型組小鼠明顯出現毛色灰暗、豎毛、弓背、活動減少、食欲減退、體質量持續減輕的衰老體征，個別出現皮膚潰爛現象，證明衰老模型造模成功；各受試組小鼠的一般情況均有不同程度的改善，如毛發較前潤澤、行動變得靈活，飲食增進等。

3.1.2 小鼠體質量的變化 給藥前，各組小鼠體質量無顯著性差異（P＞0.05）。 給藥15 d 后，衰老模型組小鼠體質量增長明顯緩慢， 與空白對照組相比，具有顯著性差異（P＜0.01）。 給藥結束后，普通酸奶組、瓊玉膏酸奶組、瓊玉膏組均能不同程度地減緩衰老小鼠的體質量下降，與衰老模型組相比，均有顯著性差異（P＜0.01 或P＜0.05），其中瓊玉膏酸奶組體質量增加最明顯。 見表1。

3.2 瓊玉膏酸奶對心、肝、腦、脾指數的影響

與空白對照組比較，衰老模型組小鼠的心、脾、肝、腦指數均顯著降低（P＜0.01），表明衰老小鼠的心、脾、肝、腦萎縮。 瓊玉膏酸奶組與模型組相比，心、脾、肝、腦指數均顯著增加（P＜0.01）。與普通酸奶組、瓊玉膏組相比，瓊玉膏酸奶組除肝指數，其它臟器指數都有顯著差異（P＜0.01）。 見表2。

3.3 瓊玉膏酸奶對D-半乳糖致衰老小鼠肝組織SOD、CAT、GSH-Px 活力和MDA 含量的影響

與空白對照組相比， 衰老模型組小鼠肝臟組織中SOD、CAT 和GSH-Px 活性顯著降低 （P＜0.01），MDA 含量顯著增高（P＜0.01）。與衰老模型組相比，普通酸奶組、瓊玉膏酸奶組、瓊玉膏組均可顯著增高肝組織的SOD、CAT 和GSH-Px 活性， 并顯 著降 低MDA 含量，差異有統計學意義（P＜0.01）；與普通酸奶組相比，瓊玉膏酸奶組小鼠肝臟組織中SOD、CAT 和GSH-Px 活性、MDA 含量差異均極顯著（P＜0.01）；與瓊玉膏組相比，瓊玉膏酸奶組小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px 活性、MDA 含量差異均極顯著 （P＜0.01），CAT 活性差異顯著（P＜0.05）。 見表3。

3.4 瓊玉膏酸奶對D-半乳糖致衰老小鼠心肌組織SOD、CAT、GSH-Px 活力和MDA 含量的影響

與空白對照組相比，D-半乳糖致衰模型小鼠心肌組織中SOD、CAT 和GSH-Px 活性顯著降低 （P＜0.01），MDA 含量顯著增高(P＜0.01）。 與衰老模型組相比，瓊玉膏酸奶組、瓊玉膏組均可顯著增高SOD、CAT 和GSH-Px 活性（P＜0.01），并顯著降低MDA 含量（P＜0.01）， 普通酸奶組可顯著增高SOD、GSH-Px活性（P＜0.01）和降低MDA 含量（P＜0.01）；與普通酸奶組相比，瓊玉膏酸奶組小鼠心肌組織中SOD、CAT和GSH-Px 活性、MDA 含量差異均極顯著 （P＜0.01）；與瓊玉膏組相比，瓊玉膏酸奶組小鼠心肌組織中CAT、GSH-Px 活性差異均顯著（P＜0.05），MDA含量、SOD 活性差異極顯著（P＜0.01）。 見表4。

表1 各組小鼠體質量的變化 （±s，n=10，g）

表1 各組小鼠體質量的變化 （±s，n=10，g）

注：與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與普通酸奶組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與瓊玉膏組比較★P＜0.05，★★P＜0.01。 下表同。

組 別空白對照組衰老模型組普通酸奶組瓊玉膏組瓊玉膏酸奶組0 d 19.15±1.32 19.13±0.79 19.17±1.00 19.18±0.85 19.19±1.34 7 d 25.06±1.62 23.78±2.10 24.58±2.90 24.44±1.96 24.61±2.62 15 d 30.74±1.96 25.80±1.48**29.78±4.51 29.18±2.07##30.91±1.81##21 d 35.02±0.61 28.99±0.53**33.32±5.16 32.70±4.92 34.93±5.12#30 d 36.09±3.69 28.94±1.22**36.46±6.04#37.06±5.33##38.94±4.26##

表2 各組小鼠臟器指數變化 （±s，n=10，mg/g）

表2 各組小鼠臟器指數變化 （±s，n=10，mg/g）

組 別空白對照組衰老模型組普通酸奶組瓊玉膏組瓊玉膏酸奶組心5.47±0.66 4.46±0.22**4.70±0.13 4.67±0.15 5.04±0.13##▲▲★★脾5.80±0.16 4.18±0.11**4.77±0.10##4.91±0.12##5.25±0.19##▲▲★★肝51.43±4.86 42.52±1.83**44.12±5.59 45.25±4.81 47.76±2.07##腦16.61±0.22 12.24±0.50**15.33±0.48##14.13±0.45##16.49±0.31##▲▲★★

表3 各組小鼠肝臟組織中SOD、CAT、GSH-Px 活力和MDA 的含量比較 （±s，n=10）

表3 各組小鼠肝臟組織中SOD、CAT、GSH-Px 活力和MDA 的含量比較 （±s，n=10）

組 別空白對照組衰老模型組普通酸奶組瓊玉膏組瓊玉膏酸奶組SOD(U/mgprot)123.4±7.86 74.4±2.89**98.3±3.18##84.5±2.65##107.2±4.92##▲▲★★CAT(U/mgprot)23.3±3.04 9.5±0.60**14.8±1.06##14.9±1.85##17.1±1.10##▲▲★GSH-Px(活力單位)475.8±30.36 346.8±17.51**386.9±9.72##400.9±8.36##430.4±16.09##▲▲★★MDA(nmol/mgprot)0.35±0.03 1.17±0.06**0.69±0.02##0.83±0.04##0.51±0.02##▲▲★★

表4 各組小鼠心肌組織中SOD、CAT、GSH-Px 活力和MDA 的含量 （±s，n=10）

表4 各組小鼠心肌組織中SOD、CAT、GSH-Px 活力和MDA 的含量 （±s，n=10）

組 別空白對照組衰老模型組普通酸奶組瓊玉膏組瓊玉膏酸奶組SOD(U/mgprot)116.2±4.67 68.0±4.70**75.7±1.95##84.5±2.65##97.0±7.10##▲▲★★CAT(U/mgprot)3.85±0.95 1.75±0.40**2.40±0.88 2.69±0.69##3.51±0.62##▲▲★GSH-Px(活力單位)46.13±2.32 15.71±0.92**26.56±1.25##23.98±2.84##30.21±2.95##▲▲★MDA(nmol/mgprot)2.10±0.09 10.3±0.40**7.09±0.62##5.11±0.90##3.76±0.28##▲▲★★

3.5 對小鼠肝、腦形態結構的影響

3.5.1 肝組織形態學變化 空白對照組小鼠肝細胞呈條索狀整齊排列，形態規則，界限清晰，細胞間隙小，肝細胞未見水腫及脂肪變性，未見固縮及嗜酸性變，未見凋亡、壞死及炎細胞浸潤，肝竇可見。 衰老模型組肝索排列紊亂，細胞形態不規則，界限模糊，肝細胞之間連接松散、間隙大，大量細胞過度收縮，染色質固縮，肝細胞嗜酸性變。 普通酸奶組、瓊玉膏酸奶組、瓊玉膏組肝索排列較整齊，界限較清，核固縮細胞明顯減少，其中瓊玉膏酸奶組肝組織細胞形態結構接近于空白對照組。 見封三彩圖圖1。

3.5.2 腦組織形態學變化

3.5.2.1 小鼠大腦皮質HE 染色結果 空白對照組小鼠大腦皮質神經細胞形態正常，排列整齊，胞核清晰，胞質豐富，著色正常，間質無水腫。 與空白對照組相比，衰老模型組小鼠大腦皮質神經細胞數量顯著減少，排列疏松，部分神經元細胞變性，核固縮，呈現三角形或不規則形。 與衰老模型組相比，普通酸奶組、瓊玉膏酸奶組、瓊玉膏組小鼠大腦皮層神經細胞排列較整齊， 變性細胞數量顯著減少，其中瓊玉膏酸奶組小鼠大腦皮質神經細胞形態接近于空白對照組。 見封三彩圖圖2。

3.5.2.2 小鼠海馬組織HE 染色結果 空白對照組小鼠海馬區有4～5 層錐體細胞， 排列緊密整齊，層次清楚，形態結構清晰完整，染色均勻，細胞胞漿豐富，核仁深染，核圓形，無固縮或溶解。 衰老模型組小鼠海馬錐體細胞數量減少，排列疏松紊亂，邊界不清，細胞變性，部分神經細胞核固縮變形，細胞漿減少。 普通酸奶組小鼠海馬錐體細胞數量較少，排列疏松，有少量細胞核固縮。 瓊玉膏酸奶組小鼠海馬錐體細胞數量有所增多，排列基本正常，邊界清晰，細胞核固縮少見。 瓊玉膏組小鼠海馬神經元數量較少，排列較密集，邊界欠清，可見少量核固縮細胞。 見封三彩圖圖3。

3.5.2.3 小鼠海馬組織尼氏染色結果 空白對照組小鼠海馬組織神經元細胞排列整齊均勻，尼氏小體豐富，輪廓清晰。 與空白對照組相比，衰老模型組小鼠海馬組織部分神經元細胞輪廓模糊，胞間間隙變大，變性細胞較多，尼氏小體數量減少。 普通酸奶組、瓊玉膏組小鼠神經元細胞排列均勻，輪廓較清晰，變性細胞較衰老模型組減少，尼氏小體較衰老模型組增多。 瓊玉膏酸奶組神經元細胞在細胞排列、尼氏小體數目有明顯改善，接近正常組。 見封三彩圖圖4。

4 討論

祖國醫學認為，人體健康長壽，其本質就在于臟腑功能的正常協調，即心、肝、脾、肺、腎五臟的共同協調運作。 衰老是五臟虛損共同作用的結果。

本研究將牛乳與瓊玉膏這兩種皆具抗衰作用的藥食相配伍， 運用現代工藝， 制作出抗衰老藥膳——瓊玉膏酸奶。 方中牛乳作為一種藥食同源的食品，可補虛損，益肺胃，養血，生津潤燥。 瓊玉膏首見于宋代·洪遵的《洪氏集驗方》卷一引申鐵翁方，由生地黃、茯苓、人參、蜂蜜組成，具有滋陰潤肺、健脾益胃、益心補腎、調補氣血等作用[3]，是集治療與保健為一體的中醫古方[4]。 有文獻表明瓊玉膏能通過多種途徑起到抗衰老作用[5]。

西醫認為衰老是體內外各種綜合因素(包括基因、營養、飲食、生活方式、心理狀態、環境因素等)共同作用的結果[6]。 目前比較公認的學說之一——氧化自由基學說認為在生命活動過程中，體內過量的自由基的產生，會導致組織細胞、生物大分子等氧化損傷和器官功能衰退， 誘導及加速機體衰老，并最終導致死亡[7]。

正常情況下， 機體的內源性酶抗氧化系統和外源性非酶抗氧化系統（抗氧化劑）可減緩氧化應激帶來的危害， 以維持體內自由基產生和清除的平衡[8]。內源性酶抗氧化系統中的SOD、CAT、GSH-Px 三者相互協調達到及時清除自由基的目的。MDA 是自由基代謝的最終產物，其含量可反映機體氧化損傷的程度，是老化的重要指標。

伴隨著衰老，肝細胞功能發生改變，主要是形態學改變。 劉國安等[9]實驗研究表明小鼠模型組肝組織與對照組比較，肝索排列紊亂，細胞間隙大，細胞形態不規則，界限模糊，大量細胞過度收縮，染色質固縮。 神經元數目的減少是腦老化過程的重要標志，其病理改變主要見于大腦皮質和海馬。 其中海馬又是最易受衰老影響的腦區之一[10]，故許多學者將海馬作為腦衰老研究的重要指標[11]。

本研究表明，瓊玉膏酸奶可通過提高機體抗氧化酶的活性，減少自由基的生成；改善衰老模型小鼠肝、腦組織細胞形態，保護衰老模型小鼠神經元細胞，達到延緩衰老的作用。 本文為瓊玉膏酸奶抗衰老機制的進一步研究及開發利用提供了實驗依據。

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