闊葉十大功勞總生物堿提取及小檗堿含量測定

周先強，田丹妹，余林健，許榮煌，唐金山，姚志紅*

（暨南大學藥學院，中藥及天然藥物研究所及中藥藥效物質基礎及創新藥物研究廣東省高校重點實驗室，廣東 廣州510632）

中藥闊葉十大功勞為小檗科（Berberidaceae）十大功勞屬闊葉十大功勞 [Mahonia bealei（Fort.）Carr.]的莖[1]，具有滋陰補陽、清熱解毒的功效，主治肺熱、咳嗽、腸炎、痢疾、瘡瘍和濕疹等癥[2]。

闊葉十大功勞的主要活性物質為生物堿類化合物[3]，其中小檗堿為主含成分。 小檗堿的降血脂作用最初在實驗性治療非胰島素依賴型糖尿病模型中被發現[4]，其后受到國內外研究學者關注。 研究表明[5-6]，給高脂模型的實驗鼠每天灌胃150～162 mg/kg 的小檗堿，6 周后實驗鼠的游離脂肪酸比模型組明顯降低；前期本課題組通過廣泛篩選的方法， 發現中藥闊葉十大功勞具有明顯的HMGCoA 還原酶抑制活性，提示其具有良好的降血脂活性，對其中生物堿類成分進一步研究發現，小檗堿和巴馬汀均顯示出HMG-CoA 還原酶抑制活性。

因此，本實驗以總生物堿提取率為指標，采用紫外分光光度法測定總生物堿含量，結合正交設計法進行闊葉十大功勞中總生物堿提取工藝的篩選和優化， 并對其中主要活性成分小檗堿建立HPLC含量測定方法。

1 儀器與材料

Agilent 1100 Series 高效液相色譜儀(G1379A在線脫氣機、G1313A 四元梯度泵、G1311A 自動進樣器、G1365B 紫外檢測器，美國Agilent 公司)；JASCO V-550 紫外可見分光光度計（佳司科（上海）貿易有限公司）；Sartorius BP211D 電子天平(德國Sartorius 公司)；昆山KQ3200E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

鹽酸小檗堿對照品（上海睿升化工科技有限公司，批號：20131201，純度98.9%）；闊葉十大功勞提取物由本課題組提供；甲醇（迪馬科技公司）、甲酸(廣州泛宏貿易有限公司)、乙腈（迪馬科技公司）均為色譜純；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。闊葉十大功勞藥材在廣西武鳴縣雙橋鄉采集，由廣西中醫藥大學的韋松基教授鑒定為闊葉十大功勞（M. bealei）。

2 實驗方法與結果

2.1 總生物堿含量測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液制備方法 取鹽酸小檗堿對照品，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用含1‰甲酸的甲醇溶解并定容，搖勻，配制成0.1 mg/mL 溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液制備方法 取闊葉十大功勞提取物粉末，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，用含1‰甲酸的甲醇溶解并定容，搖勻，配制成0.4 mg/mL 溶液，備用。

2.1.3 標準曲線的制備 分別精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL， 置10 mL 容量瓶中，用含1‰甲酸的甲醇定容，搖勻，在345 nm 處測定其吸光度（A）值。 以A 值為縱坐標，質量濃度C（μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程

結果表明鹽酸小檗堿在2.2～13.2 μg/mL 線性關系良好。

2.1.4 精密度試驗 鹽酸小檗堿對照品溶液在高、低兩個濃度下RSD 分別為0.42%和0.54%，表明儀器的精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 24 h 內對照品及樣品溶液吸光度值RSD 分別為0.73%和1.08%，表明對照品及樣品溶液在24 h 內穩定。

2.1.6 重復性試驗 取同一批次闊葉十大功勞提取物，精密稱定，按“2.1.2”項下平行制備6 份闊葉十大功勞提取物的供試品溶液，同“2.1.3”測定，計算其含量的RSD 為2.54%，表明方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 精密吸取樣品溶液（已知總生物堿含量）6 份，每份0.4 mL，分別按相當于樣品溶液中總生物堿含量加入鹽酸小檗堿對照品溶液，在345 nm 處測定其吸光度，計算回收率，結果平均回收率為100.0%，RSD 為1.14%， 表明該方法準確可靠。 見表1。

表1 總生物堿中鹽酸小檗堿加樣回收率試驗

2.2 總生物堿提取工藝的優化

2.2.1 因素水平的設計 選擇影響常規回流提取的四個因素，即乙醇濃度、提取次數、乙醇用量、提取時間，因素水平設計見表2。

表2 提取工藝因素水平表

2.2.2 正交試驗方法設計[7]與結果 取200 g 闊葉十大功勞藥材，在平行條件下按照L9(34)正交表安排進行加熱回流提取試驗，每個樣品提取完畢，濾過，合并濾液，旋蒸至一定的體積，冷凍干燥，得闊葉十大功勞總浸膏得率， 以總生物堿提取率為考察指標進行工藝優選。 結果見表3。

以總生物堿為考察指標，由表3 中極差R 值大小顯示， 各因素作用主次為A＞B＞D＞C （即乙醇濃度＞提取次數＞提取時間＞乙醇用量），表4 方差分析結果表明乙醇濃度對收率有高度顯著影響，提取次數和提取時間對生物堿收率有顯著影響，最佳工藝條件為A2B3C1D2（即6 倍量濃度為80%乙醇提取4次，每次2 h）。

表3 L9(34)正交試驗設計與結果 (n=2)

表4 總生物堿提取率方差分析表

2.3 闊葉十大功勞提取物中小檗堿含量HPLC 測定方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱Phenomenex C18色譜柱（4.6 μm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-水（各含體積分數為0.1%的甲酸）； 梯度洗脫0 min～15 min，28%～30%，流速1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長345 nm；進樣量2 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 取鹽酸小檗堿對照品約2 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇適量溶解，用甲醇定容，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液制備方法 取闊葉十大功勞提取物約10 mg，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，加甲醇適量，搖勻，超聲處理(功率150 W，頻率40 kHz)30 min， 取出， 放冷至室溫， 用甲醇定容， 搖勻，0.45 μm 微孔膜濾過，取續濾液即得。

2.3.4 線性和范圍考察 取對照品鹽酸小檗堿適量，按“2.3.2”項下制備對照品溶液。 精密吸取此對照品溶液0.2、0.7、1.2、1.7、2.2、2.7 mL， 置5 mL 容量瓶中，并用甲醇定容，按“2.3.1”色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以峰面積A 為縱坐標，以鹽酸小檗堿濃度C 為橫坐標進行線性回歸計算，得鹽酸小檗堿線性回歸方程為：

表明小檗堿在36.00～486.0 μg/mL 范圍內線性關系良好。 色譜圖見圖1。

2.3.5 重復性試驗 取同一批闊葉十大功勞提取物粉末，分別按“2.3.3”項下平行制備6 份闊葉十大功勞提取物的供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件，依次進樣6 針，記錄色譜圖。 結果顯示小檗堿平均含量為98.07 mg/mL，RSD 為2.05%，表明方法重復性良好。

2.3.6 精密度試驗 取同一份闊葉十大功勞提取物的供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件，連續進樣6針，記錄色譜圖結果顯示鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.87%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗 取同一份闊葉十大功勞提取物的供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12 h 進樣，記錄色譜圖。 結果顯示鹽酸小檗堿峰面積的RSD 為2.32%，表明供試品溶液在12 h 內穩定。

2.3.8 加樣回收率試驗 取鹽酸小檗堿對照品約10 mg，精密稱定，置20 mL 容量瓶，按“2.3.2”項下制備對照品溶液。 取同一批闊葉十大功勞提取物粉末6 份約5 mg，精密稱定，置5 mL 容量瓶，加甲醇適量，并分別加入1 mL 對照品溶液，超聲處理(功率150 W，頻率40 kHz) 30 min，取出，放冷至室溫，用甲醇定容，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續濾液按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算回收率，見表5，加樣回收率的RSD 值為0.53%，表明該方法的準確度良好。

表5 闊葉十大功勞中小檗堿的加樣回收率實驗 （n=6）

A 闊葉十大功勞提取物供試品；B 鹽酸小檗堿對照品

2.3.9 提取物中小檗堿含量的HPLC 測定 取同一批闊葉十大功勞提取物粉末，分別按“2.3.3”項下制備闊葉十大功勞提取物的供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件，依次進樣。 按“2.3.4”項下的線性回歸方程進行計算，結果闊葉十大功勞提取物中的小檗堿含量為（108.37±6.00）mg/g。

3 討論

3.1 關于紫外分光光度法測定總生物堿含量的波長選擇

在190～500 nm 波長范圍內的掃描結果表明：對照品溶液和供試品溶液的光譜圖基本一致，均在（345±2）nm 處有最大吸收峰， 故選擇345 nm 作為測定波長。

3.2 關于樣品的前處理方法考察

本實驗采用超聲的方法對樣品進行前處理，分別考察了20%甲醇-水、60%甲醇-水和甲醇3 種不同比例的提取溶劑，結果以甲醇為提取溶劑時小檗堿峰面積遠大于其他兩種方式， 且分離度符合要求。 比較不同超聲時間處理后的樣品圖譜，發現超聲30 min 與超聲60 min 的峰面積相差不大且分離度相同，均遠大于超聲10 min。 因此確定了樣品的前處理方法為以甲醇超聲提取30 min。

3.3 關于最佳提取工藝優選

采用L9(34)正交試驗進行工藝優選[8]，以有效成分總生物堿為指標，采用紫外分光光度發法測定總生物堿的量，優選出最佳工藝，可為闊葉十大功勞中總生物堿的提取提供參考。

致謝：藥農黃仕文幫助采集藥材，廣西中醫藥大學韋松基教授幫助開展闊葉十大功勞的鑒定， 余林健、許榮煌等幫助制備闊葉十大功勞提取物。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第二十九卷)[M].北京：科學出版社，2001.

[2]王筠默.中藥十大功勞的研究[J].中醫藥研究，2002，18(5)：45.

[3]李燕婧，鐘正賢.長柱十大功勞與闊葉十大功勞生物堿藥理作用比較[J].中國藥師，2010，13(9)：1 241-1 244.

[4]宋菊敏，毛 良，施建玲，等.小檗堿對非胰島依賴性糖尿病大鼠的抗氧化作用[J].中草藥，1992（23）：590-591.

[5]何明坤，陸付耳，王開富，等.小檗堿對高脂血癥伴胰島素抵抗大鼠糖脂代謝的影響[J].中國醫院藥學雜志，2004，24(7)：389-391.

[6]高從容，張家慶，黃慶玲.黃連素增加胰島素抵抗大鼠模型胰島素敏感性的實驗研究 [J]. 中國中西醫結合雜志，1997，17(3)：162-164.

[7]楊金華，王登斌，陳小明，等.首烏藤中大黃素的提取工藝研究[J].中草藥，2011，42(10)：2 017-2 019.

[8]王海寧，李 松.正交試驗優選紫百止嗽膠囊中紫菀的提取工藝[J].中草藥，2014，45(14)：2 027-2 029.