秋水仙素誘導千斤拔四倍體效果研究

蘇鈺琴++蔣向軍++莫燕蘭++李翠蘭++盤飛蘭

摘要 以桂優蔓性千斤拔種子苗為外誘導材料，采用秋水仙素進行多倍體離體誘導。結果表明，0.10%秋水仙素處理10 h，誘導率可達到20.0%，效果最好。四倍體植株相對粗壯，葉片大而厚實且皺，可作為四倍體的輔助篩選。

關鍵詞 千斤拔；種子苗；秋水仙素；四倍體；染色體檢測

中圖分類號 Q949.753.3；S567 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）17-0087-02

千斤拔為豆科千斤拔屬植物Moghania philippinens（Merr.et Rolfe）Li.的根，為《中華人民共和國藥典》（2005年版））附錄Ⅲ收載[1]。別名蔓千斤拔、吊馬樁、吊馬墩、一條根、老鼠尾、鉆地風（四川）等，以根入藥。我國云南、四川、貴州、湖北、湖南、廣西、廣東、海南、江西、福建和臺灣各省區均有分布[2]。主治風濕骨痛、腰肌勞損、慢性腎炎、跌打損傷、癰腫、偏癱、陽痿、婦女白帶多等癥，是婦科千金片、金雞沖劑、壯腰健腎丸等中成藥的主要原料藥[3-5]。已有的研究表明，千斤拔皂苷對修復神經損傷、治療老年性癡呆、抗炎鎮痛、增強免疫、抗疲勞、抗缺氧有明顯作用，中國醫科院、中國藥科大學等都設置了專門的新藥研究課題，澳大利亞等國已進入藥理試驗階段。現有常規二倍體千斤拔藥材的單株產量較低，根部纖維含量較高，不利于其中有效成分的提取。

通過倍數性育種手段使千斤拔基因組多倍化，可以獲得株型大、藥材產量高、出膏率高的品種。目前尚未發現有多倍體千斤拔及其培育方法的相關報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 外植體。桂優蔓性千斤拔優良品種所結實的飽滿種子。

1.1.2 培養基。種子萌發培養基為1/2MS+0.2%活性炭，增殖培養基為MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖3%+瓊脂5%，生根培養基1/2MS+NAA 0.5 mg/L+糖3%+瓊脂5%+0.2%活性炭，pH值均為5.8。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的準備。選取桂優蔓性千斤拔優良植株所結實的飽滿種子，在超凈工作臺上先用75%酒精處理30 s，再用0.1%升汞處理5～8 min，最后用無菌水沖洗4～6次，用經過滅菌的濾紙吸干外植體表面的水分，將種子轉接到MS+0.2%活性炭培養基中。

1.2.2 秋水仙素處理。采用過濾滅菌配制濃度分別為0.05%、0.10%、0.15%的秋水仙素溶液，將萌發的健壯種子苗進行暗培養7 d后，放到秋水仙素溶液中分別培養5、10、15 h后，以浸泡無菌水作為對照組，每個組合處理30株種苗。將苗用無菌水洗干凈，轉接到增殖培養基中進行培養。培養40 d后開始萌發新芽，在超凈工作臺上將誘導后長出的新芽轉接到生根培養基中。

1.2.3 氣孔鑒定。取同一生長時期的葉片，用解剖針在葉片的下表面取一小片白色薄膜，放在載玻片的水滴中，展平，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。

1.2.4 染色體檢測。取目標植株的根尖、莖尖0.5～2.0 cm，固定液（甲醇∶乙酸=3∶1）處理15 min以上，流動水沖洗15 min，解離液（濃鹽酸∶95%酒精=1∶1）處理2～10 min，流動水洗15 min以上，剪取0.1 mm分生組織用卡寶品紅染色后壓片，顯微鏡檢、拍照，觀察染色體數目。

2 結果與分析

2.1 多倍體誘導

從表1可以看出，隨著秋水仙素濃度的提高和處理時間的延長，處理材料受抑制程度大，當秋水仙素溶液濃度為0.15%，處理時間為15 h時，處理材料僅有15%的存活率，多數處理材料由于受到秋水仙素的毒害作用，雖轉入了增殖培養基中，但慢慢褐化失去活力。

濃度過高或過低多倍體誘導率都有所降低。在高濃度下，處理時間越長，材料存活率越低，因此秋水仙素濃度和處理時間要合理的搭配才能提高誘導率。對照組未發現有多倍體植株，說明秋水仙素有效誘導了多倍體千斤拔的產生。由此得出：0.10%秋水仙素處理10 h，誘導率可達到20.0%，效果最好。

2.2 氣孔觀察

取同一生長時期的葉片，在相同放大倍數下觀察到四倍體千斤拔植株的氣孔明顯比二倍體植株的大（圖1）。

2.3 四倍體千斤拔形態學特征

四倍體千斤拔植株的外觀形態和二倍體有明顯差異（圖2），株型較大，生長旺盛，葉片大而厚實且皺，莖桿比較粗壯；而二倍體植株和葉片小而平整，且較薄，莖桿較細。

2.4 四倍體千斤拔染色體鑒定

采用壓片法對再生植株進行染色體檢測（圖3），結果表明，經過秋水仙素誘導后的部分再生植株的染色體2n=4x=44，為四倍體；未經任何處理的二倍體植株染色體數2n=2x=22。

3 結論與討論

染色體檢測比較費時，處理植株數量很大時，很難做到每個植株都檢測。因此，先通過外觀篩選出株型較大、葉片厚且皺、莖桿粗壯的為目標植株，再對目標植株進行染色檢測，最終篩選出四倍體植株。

秋水仙素有劇毒，在組織培養的過程中對外植體有毒害的作用，明顯地抑制不定芽的分化甚至導致外植體的死亡，這與鄭永強等[6]的結論相同。千斤拔植株對秋水仙素較敏感，經過秋水仙素誘導的材料轉接到增殖培養基上，極易發生褐化現象，最后慢慢枯死。后面可以進一步研究其他多倍體誘變劑對千斤拔誘導的效果，或是添加其他物質能夠不影響秋水仙素誘導效果的前提下降低其多誘導材料的毒害作用。

4 參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫藥科技出版社，2005.

[2] 許鴻源，梁瓊月，周鳳玨，等.蔓性千斤拔的快速繁育[J].種子，2010，29（2）：89-91.

[3] 饒偉文，黃建楷，溫志芳，等.千斤拔的品種調查與質量研究[J].中草藥，1999，30（3）：219.

[4] 廣西壯族自治區衛生廳.廣西中藥材標準（1990年版）[S].南寧：廣西科學技術出版社，1992：297.

[5] 張麗霞，彭建明，馬潔.千斤拔研究進展[J].中藥材，2007，30（7）：887-890.

[6] 鄭永強，徐坤.秋水仙素在植物體細胞染色體加倍中的應用研究進展[J].中國農學通報，2003，19（5）：89-91.endprint