復方痔瘡栓的定性鑒別與定量分析方法研究

許本善 雷 寧 馬 萍 陳靖婕 吳 誠 童衛杭

解放軍第二炮兵總醫院藥學部，北京 100088

復方痔瘡栓的定性鑒別與定量分析方法研究

許本善 雷 寧 馬 萍 陳靖婕 吳 誠 童衛杭

解放軍第二炮兵總醫院藥學部，北京 100088

目的完善復方痔瘡栓的質量控制標準，保障制劑質量。 方法采用薄層色譜法對復方痔瘡栓制劑中的黃連、三七、冰片、血竭進行定性鑒別，用高效液相色譜法對制劑中的鹽酸小檗堿進行含量測定。色譜條件：色譜柱為WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調pH至3.0）（30∶70），流速為1.0 mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為345 nm。 結果薄層色譜法斑點清晰，分離度良好，陰性對照無干擾；鹽酸小檗堿線性范圍為2.7148～173.7468 μg/mL（r=0.9999，n=6），平均加樣回收率為102.43%，RSD= 0.34%（n=6）。 結論該方法簡便易行，適用于醫院制劑復方痔瘡栓的定性鑒別與定量測定。

復方痔瘡栓；鹽酸小檗堿；薄層色譜法；高效液相色譜法；定性鑒別；定量分析

復方痔瘡栓系解放軍第二炮兵總醫院（以下簡稱“我院”）特色制劑[總制字（2011）F07005]，具有活血化瘀、收斂、消炎止痛作用，用于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期內痔手術后、直腸炎、肛竇炎等。該制劑是將黃連、三七粉、冰片、血竭、龍骨、兒茶、煅赤石脂、醋乳香、醋沒藥共9味藥材細粉，與熱熔的混合脂肪酸甘油酯混勻至近凝后，注入模具冷卻制得，該制劑來源于我院多年臨床經驗，療效確切。該制劑原質量標準制訂于20世紀90年代，未對其中主要藥味及其活性成分進行定性、定量檢測。為了更好地控制制劑質量，本研究優化了制劑中黃連、三七、冰片的薄層鑒別方法，并增加了血竭的薄層鑒別方法，同時考察并建立了制劑中鹽酸小檗堿的高效液相色譜法含量測定方法。本研究結果表明，所建立的定性鑒別和定量測定方法具有較好的靈敏度和重現性，且操作簡便，能夠為醫院制劑復方痔瘡栓的質量標準的建立提供研究依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜系統（LC-20A型，日本Shimadzu公司，包括DGU-20A3脫氣機、LC-20AT二元泵、SIL-20A自動進樣器、CTO-10A柱溫箱、SPD-M20A二極管陣列檢測器、SPD-20A紫外檢測器以及LCSoLution色譜工作站）；電子天平（JM-B20002型，浙江省余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）；十萬分之一分析天平（CP225D型，德國Sartorius公司）；電熱恒溫水浴鍋（HWS28型，上海一恒科技有限公司）；超聲波發生器（KQ-500V型，蘇州昆山超聲儀器有限公司）；旋轉蒸發器（RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9070A型，上海一恒科技有限公司）；紫外分光光度儀（ZF-I型，上海顧村電光儀器廠）；薄層色譜掃描成像系統（Reprostar 3型，瑞士CAMAG公司）；超純水系統 （Synergy UV型，美國Millipore公司）。

1.2 試藥

復方痔瘡栓（批號：20120320、20141024、201503-183，我院藥學部）；黃連、三七、血竭對照藥材（批號分別為120913-201310、120941-201108、120906-200609，中國食品藥品檢定研究院）；鹽酸巴馬汀（純度：86.2%，批號：110732-201108）、鹽酸小檗堿（純度：86.7%，批號：110713-201212）、冰片（鑒別，批號：743-8902）、三七皂苷R1（純度：94.0%，批號：0754-200008）、人參皂苷Rg1（純度：95.0%，批號：0703-200117）、人參皂苷Re（純度：92.7%，批號：0754-9913）、人參皂苷Rb1（純度：93.7%，批號：110704-200420）、血竭素高氯酸鹽（純度：99.2%，批號：0811-9302）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；表小檗堿（純度：98.02%，批號：130413）、黃連堿（純度：98.55%，批號：130809）對照品均購自成都普菲德生物技術有限公司；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇、乙醇、正丁醇、香草醛、冰醋酸、鹽酸、硫酸、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、甲苯、石油醚（60～90℃）、二氯甲烷均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜法鑒別

2.1.1 黃連

取本品1粒，切碎，加甲醇25 mL，密塞，水浴（60℃）30 min，冷卻，濾過，濾液作為供試品溶液。另取黃連對照藥材0.05 g，加甲醇25 mL，同法制成對照藥材溶液。再取表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對照品，分別加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述6種溶液各1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-甲醇-冰醋酸-水（14∶7∶2∶1）為展開劑[1-2]，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。實驗結果顯示該方法分離效果好，斑點清晰，且陰性樣品無干擾，結果見圖1。

圖1 黃連的薄層色譜圖（紫外光365 nm）

2.1.2 三七

取本品15粒，加二氯甲烷50 mL，溶解，濾過，棄去濾液，殘渣揮干溶劑，加適量水浸潤并攪勻，再加水飽和正丁醇20 mL，超聲提取30 min，濾過，殘渣再超聲提取2次，合并3次濾液并蒸干，殘渣加2 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取三七對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。再取三七皂苷R1對照品，人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品，分別加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10，下層）為展開劑[3-4]，展開，晾干溶劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置紫外燈（365 nm）和日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點或斑點。實驗結果顯示該方法分離效果好，斑點清晰，且陰性樣品無干擾，結果見圖2～3。

圖2 三七的薄層色譜圖（紫外光365 nm）

圖3 三七的薄層色譜圖（日光）

2.1.3 冰片

取本品1粒，切碎，加石油醚（60～90℃）5 mL，浸泡10 min濾過，濾液作為供試品溶液。另取冰片對照品，加甲醇制成每1 mL含0.02 g的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述兩種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲苯（3∶17）為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%香草醛的10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰[5]。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。實驗結果顯示該方法分離效果好，斑點清晰，且陰性樣品無干擾，結果見圖4。

圖4 冰片的薄層色譜圖（日光）

2.1.4 血竭

取本品1粒，切碎，加二氯甲烷5 mL，溶解，濾過，作為供試品溶液。另取血竭對照藥材0.05 g，加二氯甲烷5 mL，同法制成對照藥材溶液。再取血竭素高氯酸鹽對照品，加甲醇制成每1 mL含0.26 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇（19∶1）為展開劑[3-6]，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。實驗結果顯示該方法分離效果好，斑點清晰，且陰性樣品無干擾，結果見圖5。

圖5 血竭的薄層色譜圖（紫外光365 nm）

2.2 鹽酸小檗堿含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調pH至3.0）（30∶70）[7-8]；流速：1.0 mL/min；檢測波長：345 nm；柱溫：40℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品10.02 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液定容至刻度，作為鹽酸小檗堿對照品貯備液，濃度為173.75 μg/mL。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品切碎，混勻，再取約1.0 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液95 mL，60℃水浴15 min，超聲處理（功率 500 W，頻率 40 kHz，溫度60℃）30 min，放冷，加甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液至刻度，搖勻，冰箱（4℃）冷藏4 h，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方量比例及制備工藝，取缺黃連的其他藥材制備陰性樣品。精密稱取陰性樣品，按照“2.2.2.2”項下的方法制備陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性試驗

分別取上述溶液和甲醇-鹽酸 （100∶1）溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，見圖6。結果顯示，復方痔瘡栓樣品中其他成分對鹽酸小檗堿的測定無干擾。

圖6 各溶液的高效液相色譜圖

2.2.4 線性關系考察

精密吸取“2.2.2.1”項下的鹽酸小檗堿對照品貯備液5 mL，置10 mL量瓶，加甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液定容至刻度，搖勻，再從中精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇-鹽酸（100∶1）的溶液定容至刻度，搖勻。依此法梯度稀釋，依次得到濃度為2.7148、5.4296、10.8592、21.7184、43.4367、86.8734、173.7468 μg/mL的鹽酸小檗堿系列對照品溶液。將系列對照品溶液依次進樣，按上述色譜條件測定，以峰面積積分值（Y）對濃度（X，μg/mL）進行回歸，得鹽酸小檗堿的回歸方程為：Y=43758X-14744（r=0.9999），鹽酸小檗堿的濃度在2.7148～173.75 μg/mL范圍內與其峰面積呈現良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗

精密稱取鹽酸小檗堿對照品13.20 mg，加甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液定容至50 mL，得鹽酸小檗堿對照品貯備液，濃度為228.888 μg/mL。按“2.2.4”項下的方法配制濃度為114.444 μg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液，取該溶液，按上述色譜條件分別重復進樣6次，進行測定，并記錄鹽酸小檗堿的峰面積積分值，計算其RSD=0.57%，結果表明精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗

取樣品（批號：20141024），按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液。分別于0、1、2、4、6、8、10、12 h進樣測定，記錄峰面積積分值，計算其RSD=1.66%，結果表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗

取同一批樣品（批號：20141024），按“2.2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，測定含量。結果顯示，樣品中鹽酸小檗堿的平均含量為2.6603 mg/g，RSD=1.52%，表明重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：201503183）約0.5 g，共6份，分別置100 mL量瓶中，再分別精密加入鹽酸小檗堿對照品貯備液（0.1673 mg/mL）各5 mL，按“2.2.2.2”項下方法制備即得。精密吸取上述供試液10 μL注入色譜儀，測定含量，結果平均回收率為102.43%，RSD=0.34%（n=6）。見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.2.9 含量測定

取不同批次復方痔瘡栓，分別按“2.2.2.2”項下方法處理制劑樣品并進行測定，計算每批制劑樣品中鹽酸小檗堿的含量。見表2。

表2 樣品含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 展開劑的選擇

該制劑原質量標準中黃連的薄層鑒別采用了“苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）”為展開體系，試劑苯因毒性較大已經在《中國藥典》中被禁止使用；本研究根據文獻和實驗篩選，優化展開系統為“正丁醇-甲醇-冰醋酸-水（14∶7∶2∶1）”[9-12]，能夠將來自黃連的四種生物堿類成分同板鑒別，且陰性無干擾。

3.2 提取方法的選擇

本研究在供試品溶液制備中選擇了甲醇-鹽酸（100∶1）作為提取溶劑，并先后考察了溶劑用量和提取時間，結果表明1.0 g制劑以100 mL溶劑60℃水浴15 min，超聲處理30 min，鹽酸小檗堿的提取效率最高；同時，由于栓劑基質對測定的影響，實驗中還考察了栓劑基質的分離方法，結果表明將樣品提取液采用“4℃冷藏4 h”的處理過程能夠最大限度地使栓劑基質混合脂肪酸甘油脂與待測成分分離，從而減少其對于測定結果的影響以及對色譜柱的污染。

3.3 流動相的選擇

研究曾選用乙腈-0.2%磷酸（每1 L加三乙胺1 mL）[13-15]作為流動相，結果目標峰與雜質分離度不佳；改用乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用磷酸調pH=3.0）[7-8]后待測成分與雜質實現了基線分離，并獲得了較好的峰形和較高的理論塔板數。

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Study on the methods of qualitative identification and quantitative analysis of Compound Zhichuang Suppository

XU Benshan LEI Ning MA Ping CHEN Jingjie WU Cheng TONG Weihang
Department of Pharmacy,the Second Artillery General Hospital of Chinese People's Liberation Army,Beijing 100088, China

Objective To improve the quality standard of Compound Zhichuang Suppository,so as to ensure the quality of preparations.Methods Rhizoma Coptidis,Radiχ Notoginseng,Borneolum Syntheticum and Sanguis Draconis of Compound Zhichuang Suppository were identified by thin layer chromatography.The high performance liquid chromatography method was used to determine the content of berberine hydrochloride.Chromatographic condition:the chromatographic column was WondaSil C18-WR(4.6 mm×250 mm,5 μm),the mobile phase was acetonitrile-0.05 mol/L NaH2PO4solution(pH was adjusted to 3.0 by phosphoric acid)(30∶70).The flow rate was 1.0 mL/min,the column temperature was at 40℃and the detection wavelength was 345 nm.Results The thin layer chromatography had clear spots and it was well-separated without negative interference.The good linear correlation existed within the range of 2.7148-173.7468 μg/mL for berberine hydrochloride(r=0.9999,n=6)and the average recovery was 102.43%,with RSD of 0.34%(n=6).Conclusion The method is simple and accurate,which can be used for qualitative identification and quantitative analysis of Compound Zhichuang Suppository.

Compound Zhichuang Suppository;Berberine hydrochloride;Thin layer chromatography;High performance liquid chromatography;Qualitative identification;Quantitative analysis

R284.1

A

1673-7210（2015）11（c）-0008-05

2015-07-21本文編輯：張瑜杰）

全軍醫療機構制劑標準提高科研專項課題面上項目（13ZJZ19-2）。

雷寧（1978-），女，博士，副主任藥師；研究方向：天然藥物的藥效物質基礎及質量標準。