外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞對增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病的臨床指導(dǎo)價(jià)值

龔 珂 孫文濤 呂伯昌 王欣榮 陳 濤

陜西省眼科醫(yī)療中心眼科西安市第四醫(yī)院眼科西安交通大學(xué)附屬廣仁醫(yī)院眼科，陜西西安 710004

外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞對增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病的臨床指導(dǎo)價(jià)值

龔 珂 孫文濤▲呂伯昌 王欣榮 陳 濤

陜西省眼科醫(yī)療中心眼科西安市第四醫(yī)院眼科西安交通大學(xué)附屬廣仁醫(yī)院眼科，陜西西安 710004

目的 探討外周血CD4+CD25+T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病（PDR）患者中的表達(dá)意義。 方法 選取2014年6月～2015年5月西安市第四醫(yī)院收治的玻璃體積血糖尿病視網(wǎng)膜病患者42例（PDR組）和2型糖尿病無PDR患者30例（糖尿病組），同時(shí)選取健康志愿者30例（正常對照組），采用流式細(xì)胞儀檢測各組患者外周血Treg細(xì)胞比例，同時(shí)檢測各組患者糖化血紅蛋白（HbA1c）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平。結(jié)果PDR組、糖尿病組和正常對照組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PDR組HbA1c、TG、BUN分別為（8.02±2.53）%、（2.01± 1.04）mmol/L和（7.88±1.43）mmol/L，明顯高于正常對照組的（4.92±1.38）%、（0.94±0.24）mmol/L和（3.45±1.25）mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；PDR組TC、LDL-C和Scr分別為 （5.44±1.21）mmol/L、（3.78±1.06）mmol/L和（118.63±34.16）μmol/L，明顯高于糖尿病組的（4.47±1.33）mmol/L、（2.91±1.18）mmol/L和（88.63±23.21）μmol/L及正常對照組的（3.08±1.12）mmol/L、（1.60±0.82）mmol/L和（61.32±17.21）μmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而HDL-C為（1.22±0.34）mmol/L，低于正常對照組的（4.26±1.33）mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PDR組患者外周血CD4+T細(xì)胞比例為（18.21±5.34）%，明顯低于糖尿病組和正常對照組的（24.07±4.11）%和（28.76±7.14）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3組Treg細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論外周血Treg細(xì)胞可能參與了增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病的發(fā)病機(jī)制，有待臨床進(jìn)一步研究。

增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病；流式細(xì)胞儀；CD4+CD25+T細(xì)胞；臨床研究

增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病 （proliferative diabetic retinopathy，PDR）是臨床常見的視網(wǎng)膜新生血管性疾病，是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。同時(shí)PDR也是糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopthy，DR）的中后期，患者反復(fù)出現(xiàn)玻璃體積血、牽拉性視網(wǎng)膜脫離、新生血管性青光眼，甚至導(dǎo)致失明，對患者的日常生活造成嚴(yán)重影響[1]，因此，早期診斷與治療是改善PDR患者預(yù)后的重要環(huán)節(jié)。相關(guān)文獻(xiàn)指出[2]，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）通過細(xì)胞接觸依賴機(jī)制或抑制性細(xì)胞因子依賴機(jī)制，主動(dòng)抑制患者自身免疫T細(xì)胞活化，在PDR的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究選擇西安市第四醫(yī)院收治的42例玻璃體積血糖尿病視網(wǎng)膜病患者、30例2型糖尿病無PDR患者及30例健康志愿者監(jiān)測其外周血Treg細(xì)胞比例，并分析其在PDR疾病中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年6月～2015年5月在西安市第四醫(yī)院收治玻璃體積血糖尿病視網(wǎng)膜病患者42例（PDR組）和2型糖尿病無PDR患者30例（糖尿病組），納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合Airlie House糖尿病視網(wǎng)膜病變分級(jí)[3]，PDR患者均為重度PDR，5期；②糖尿病診斷符合1999年WHO推薦的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，且眼底未見明顯出血及滲出；③患者及家屬知情同意，并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿病患者；入院1個(gè)月內(nèi)口服或靜脈應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和其他免疫抑制劑；1周內(nèi)有急性感染；有眼部其他病史。同時(shí)選取健康志愿者30例為正常對照組，無糖尿病、高血壓及其他慢性疾病史，1周內(nèi)無急性感染，無眼部病史。3組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組患者一般資料比較（）

表1 3組患者一般資料比較（）

PDR組糖尿病組正常對照組F/χ2值P值42 30 30 57.52±10.26 58.16±9.13 57.78±11.30 0.964＞0.05 19/23 12/18 11/19 0.555＞0.05

1.2 試劑及儀器

FITC熒光標(biāo)記的抗人CD抗體、PE標(biāo)記的抗人CD25抗體、PE-Cy5標(biāo)記的Foxp3試劑盒及所有抗體均購自eBioscience公司，熒光定量PCR試劑盒購于北京康為世紀(jì)有限公司。

1.3 標(biāo)本采集及細(xì)胞分離

采用真空抗凝管抽取所有患者肘靜脈血約5 mL，采用淋巴細(xì)胞分離液制備外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用PBS洗滌后制備單細(xì)胞懸液。取150 μL外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液，向其中加入10 μL的FITC標(biāo)記的CD4抗體和PE標(biāo)記的CD25抗體，室溫避光30 min，加入2 mL冷PBS，1000 r/min，5 min離心洗滌，然后加入1 mL破膜劑反應(yīng)1 h后加入透膜緩沖液，離心后重懸，加入10 μL的PE-Cy5標(biāo)記的Foxp3抗體，室溫避光30 min，加入2 mL冷PBS，1000 r/min，離心5 min，然后加入500 μL的PBS重懸。

1.4 流式細(xì)胞儀術(shù)檢測外周血CD4+CD25+T細(xì)胞

采用流式細(xì)胞儀檢測各組患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞比例，同時(shí)檢測各組患者糖化血紅蛋白（HbA1c）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）等。所有標(biāo)本采用美國Beckerman Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀，其光源為15 mW氬離子激光器所生產(chǎn)的激光，且波長約為488 nm。采用Expo32ADC分析系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)，將flow-check（TM）flourpheres（10 um）的熒光微球 （REF6605359.beckman coulter，Inc.full erton，CA92835）作為檢測前的標(biāo)準(zhǔn)樣品，校正儀器的CV值在2%內(nèi)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較用方差分析，兩組間比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組相關(guān)觀察指標(biāo)的比較

PDR組、糖尿病組和正常對照組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；PDR組和糖尿病組的HbA1c、TG、BUN、TC、LDL-C和Scr均明顯高于正常對照組 （P＜0.05）；PDR組TC、LDL-C和Scr明顯高于糖尿病組和正常對照組（P＜0.05），而HDL-C低于正常對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 3組相關(guān)觀察指標(biāo)比較（）

表2 3組相關(guān)觀察指標(biāo)比較（）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與糖尿病組比較，△P＜0.05；HbA1C：糖化血紅蛋白；TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；Scr：血清肌酐；BUN：尿素氮

組別 例數(shù) HbA1C（%） TG（mmol/L） TC（mmol/L） LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L） Scr（μmol/L） BUN（mmol/L）PDR組糖尿病組正常對照組F值P值42 30 30 8.02±2.53▲7.81±3.10▲4.92±1.38 12.543＜0.05 2.01±1.04▲1.83±0.73▲0.94±0.24 11.021＜0.05 5.44±1.21▲△4.47±1.33▲3.08±1.12 8.417＜0.05 3.78±1.06▲△2.91±1.18▲1.60±0.82 7.608＜0.05 1.22±0.34▲△0.99±0.31▲4.26±1.33 15.031＜0.05 118.63±34.16▲△88.63±23.21▲61.32±17.21 23.872＜0.05 7.88±1.43▲7.05±2.37▲3.45±1.25 24.032＜0.05

2.2 外周血Treg細(xì)胞檢測結(jié)果

PDR組患者外周血CD4+T細(xì)胞比例明顯低于糖尿病組和正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；糖尿病組外周血CD4+T細(xì)胞比例明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3組Treg細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖1。

表3 3組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞檢測結(jié)果（%，）

表3 3組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞檢測結(jié)果（%，）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與糖尿病組比較，△P＜0.05；HbA1C：糖化血紅蛋白；TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；Scr：血清肌酐；BUN：尿素氮；Treg細(xì)胞：CD4+CD25+T細(xì)胞

組別 例數(shù) CD4+T細(xì)胞 Treg細(xì)胞PDR組糖尿病組正常對照組F值P值42 30 30 18.21±5.34▲△24.07±4.11▲28.76±7.14 9.544＜0.05 2.16±0.82 2.20±0.47 2.31±0.53 1.083＞0.05

圖1 各組流式細(xì)胞儀檢測圖

3 討論

DR是臨床常見的致盲性眼病，主要是因糖尿病患者機(jī)體內(nèi)胰島素與血糖等代謝異常所致血液成分變化，誘發(fā)微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，破壞了視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞色素上皮細(xì)胞間的聯(lián)合，造成小血管滲漏，導(dǎo)致眼部血管微循環(huán)變化，破壞血-視網(wǎng)膜屏障，損害視力功能[5]。PDR是DR疾病的中后期，其發(fā)病率約占DR的6.96%，視網(wǎng)膜缺血誘發(fā)新生血管異常生長與繼發(fā)性纖維組織增殖，且常伴有視網(wǎng)膜前或玻璃體積血[6]。長期的高血糖是PDR病變的決定性因素，除此之外，高血壓與高血脂也是PDR發(fā)生的危險(xiǎn)因素[7]。本研究中，PDR組患者HbA1c、TG、BUN水平均明顯高于正常對照組 （P＜0.05）；PDR組患者的TC、LDL-C和Scr水平均明顯高于糖尿病組和正常對照組，HDL-C則低于正常對照組（P＜0.05），這提示高血脂在PDR中發(fā)揮重要作用，且血脂指標(biāo)參與了PDR的發(fā)病過程。近年來隨著細(xì)胞與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞因子在PDR疾病中的發(fā)展起到了重要作用，已引起臨床學(xué)者們的關(guān)注與研究，為臨床診斷PDR提供了新思路[8]。

Treg細(xì)胞是一組具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞群，是健康個(gè)體T細(xì)胞庫的組成成分，主要通過細(xì)胞接觸依賴機(jī)制或抑制性細(xì)胞因子依賴機(jī)制，主動(dòng)抑制患者自身免疫T細(xì)胞活化，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，抑制機(jī)體對同種異體移植物的排斥，維持自身免疫耐受力，預(yù)防自身免疫疾病[9-12]。CD4+表達(dá)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面，是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞慢性活化階段的分子標(biāo)記，對其增殖、生存及功能產(chǎn)生較大影響[13-15]。本研究中PDR組患者外周血CD4+T細(xì)胞比例明顯低于糖尿病組和正常對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但3組Treg細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PDR患者外周血CD4+T細(xì)胞比例較低的原因可能為PDR患者機(jī)體中外周血單個(gè)核細(xì)胞靜止時(shí)Treg細(xì)胞活化后變?yōu)镃D4+CD25+的效應(yīng)性T細(xì)胞的結(jié)果。HbA1c測試一般可以反映患者近期的血糖控制情況，是PDR疾病發(fā)生與發(fā)展的危險(xiǎn)因素之一。相關(guān)文獻(xiàn)指出[16-20]，PDR患者血脂與 HbA1c水平異常時(shí)，約50%患者伴有糖尿病腎病，且機(jī)體炎癥與血脂紊亂具有密切聯(lián)系。

綜上所述，免疫調(diào)節(jié)紊亂參與了PDR的發(fā)病機(jī)制，外周血Treg細(xì)胞的免疫應(yīng)答可能在PDR疾病的發(fā)展中起到了重要作用，有待臨床加大樣本量進(jìn)一步深入研究。

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The clinical value of peripheral blood CD4+CD25+T cells on patients with proliferative diabetic retinopathy

GONG Ke SUN Wentao▲LU Bochang WANG Xinrong CHEN Tao
Department of Ophthalmology,Shaanxi Province Ophthalmology Medical Center,Xi'an No.4 Hospital,Guangren Hospital of Xi'an Jiaotong University,Shaanxi Province,Xi'an 710004,China

Objective To investigate the expression of CD4+CD25+T cells in patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR).Methods From June 2014 to May 2015,42 cases of patients with vitreous hemorrhage diabetic retinopathy (PDR group)and 30 patients of type 2 diabetes without PDR (diabetic group)were selected in Xi'an NO.4 Hospital,at the same time,30 healthy volunteers (control group)were also included.Peripheral blood CD4+CD25+T cell was detected in every group by flow cytometry,and the glycosylated hemoglobin(HbA1c),triglyceride(TG),total cholesterol (TC),low-density lipoprotein(LDL-C),low-density lipoprotein(HDL-C),urea nitrogen(BUN)were tested.Results Age, gender differences in PDR group,diabete group and control group had no statistical significance (P＞0.05);the levels of HbA1c,TG,BUN in PDR group were(8.02±2.53)%,(2.01±1.04)mmol/L and(7.88±1.43)mmol/L,significantly higher than the normal group (P＜0.05);the levels of TC,LDL-C and Scr in PDR group were(5.44±1.21)mmol/L,(3.78± 1.06)mmol/L and(118.63±34.16)μmol/L,significantly higher than the diabetic group and control group(P＜0.05),but HDL-C(1.22±0.34 mmol/L)was lower than the control group(P＜0.05);peripheral blood CD4+T cell in PDR group was(18.21±5.34)%,significantly lower than that of diabetes group and control group [(24.07±4.11)%and (28.76± 7.14)%],the differences were statistically significant(P＜0.05).The differences of CD4+CD25+T cells among the three groups were not statistically significant (P＞0.05).Conclusion The peripheral blood CD4+CD25+T cells may be involved in the pathogenesis of proliferative diabetic retinopathy,pending further clinical research.

Proliferative diabetic retinopathy;Flow cytometry;CD4+CD25+T cells;Clinical research

R774.1

A

1673-7210（2015）11（c）-0017-04

2015-07-08本文編輯：關(guān) 婧）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81273902）。▲