三種方法測定糖化血紅蛋白的一致性和可靠性分析

荊丹清 陳玉靜 尹士男 賈 喆

解放軍總醫院第一附屬醫院內分泌科，北京 100048

三種方法測定糖化血紅蛋白的一致性和可靠性分析

荊丹清 陳玉靜 尹士男 賈 喆

解放軍總醫院第一附屬醫院內分泌科，北京 100048

目的探討微粒色譜法、親和層析法與高效液相色譜（HPLC）法測定糖化血紅蛋白（GHb）的一致性和可靠性。 方法 選取2014年6～9月在解放軍總醫院第一附屬醫院門診及住院治療的137例糖尿病患者為研究對象，空腹抽取雙份全血標本。利用微粒色譜法、親和層析法及HPLC法分別測定糖化血紅蛋白A1（HbA1c），每份標本測定2次。將入組的137例糖尿病患者參照HPLC法測定的HbA1c為金標準分為3組：第1組HbA1c含量 ≤6.5%；第2組6.5%＜HbA1c含量 ＜7.5%；第3組HbA1c含量≥7.5%，分析各組人群采用的3種不同檢測方法組間差異是否有統計學意義。以Bio-Rad D10 HPLC測定的GHb為目標系統，以微粒色譜法和親和層析法為試驗系統，建立回歸方程，分析試驗系統與目標系統檢測結果的偏差程度。 結果3種方法測定HbA1c值組內比較差異無統計學意義（P＞0.05）；回歸分析顯示，微粒色譜法與HPLC法所測的HbA1c值呈良好的線性關系，Y=1.006 X +0.213，相關指數r2=0.885；層析法與HPLC法測定結果亦呈良好的線性關系，Y=0.923 X+0.338，相關指數r2= 0.917；對于不同的糖尿病人群，3種方法檢測結果亦呈現良好的相關性。 結論微粒色譜法和親和層析法均能為臨床提供與HPLC法所測糖化血紅蛋白偏差較小的可靠數據，檢驗結果可被臨床接受。微粒色譜法操作簡單、快速，可為臨床快速診斷提供方便。

糖化血紅蛋白；離子交換高效液相色譜法；微粒色譜法；親和層析法

糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，GHb）是血紅蛋白與糖類非酶促結合的產物，它的合成緩慢而且是不可逆的。它反映3個月左右的平均血糖水平，克服了飲食時間、空腹時間、服藥時間的干擾，在患者血糖或尿糖波動較大時有特殊意義[1]。糖化血紅蛋白A1（HbA1c）在糖尿病的篩選、制訂糖尿病患者的治療方案及對血糖控制水平的評價上有很高的臨床價值[2-3]。HbA1c的檢測方法很多，目前，臨床上通用的HbA1c檢測的金標準是非多孔陽離子交換柱的高壓液相層析法，但因儀器價格昂貴基層醫院不能普及，而且檢測時間較長，操作復雜，不能滿足門、急診患者的要求。尋找更加方便、快速、準確檢測HbA1c的方法就顯得尤為重要。本研究對137例糖尿病患者分別采用3種方法測定HbA1c（親和層析法測定的是糖化血紅蛋白總量），旨在比較3種檢測方法所測HbA1c的可靠性、操作的方便性及快捷性。本組數據顯示，NycoCard readerⅡ床旁HbA1c分析儀采用微粒色譜法（小旋風）以及用親和層析法與傳統的高效液相色譜（HPLC）法所測數據均有良好的相關性，且微粒色譜法的優勢是較親和層析法操作簡單、快捷，適合床旁患者快速檢測，現將試驗結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年6～9月于解放軍總醫院第一附屬醫院（以下簡稱“我院”）內分泌門診及內分泌科住院治療的137例糖尿病患者為研究對象，其中男71例，女66例，年齡23～87歲，平均（57.3±28.9）歲，患者糖尿病史0.5～51年。檢測前經醫院倫理委員會批準，并由患者簽訂知情同意書。

1.2 儀器與試劑

目標系統檢測方法為離子交換HPLC法，利用Bio-Rad D10糖化血紅蛋白測定儀（北京市衛生部臨床檢驗中心質檢合格）測定HbA1c；試驗系統為微粒色譜法和親和層析法，微粒色譜法利用 NycoCard READERⅡ特種蛋白金標檢測儀（小旋風），親和層析法利用Premier Hb9210糖化血紅蛋白測定儀測定糖化血紅蛋白，對比其差異結果。試劑為實驗室常規的檢測試劑，經臨床實驗證實有良好的穩定性。

1.3 檢測方法

137例患者清晨抽取靜脈血2 mL各2份，EDTA-K2抗凝。由3名技師分別負責3種儀器對標本進行檢測，檢測方法嚴格按照檢測程序說明進行。全組中根據Bio-Rad D10測定的糖化血紅蛋白值將患者分為3組：HbA1c含量≤ 6.5%、6.5%＜HbA1c含量＜7.5%、HbA1c含量≥7.5%，分析各組人群采用的3種不同檢測方法組間差異是否有統計學意義。以Bio-Rad D10糖化血紅蛋白測定儀測定的糖化血紅蛋白為目標系統（臨床檢測的金標準），以微粒色譜法和親和層析法為試驗系統，建立回歸方程，分析試驗系統與目標系統檢測結果的偏差程度。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件對所測數據進行處理和分析，計量資料用均數±標準差（）表示，組間及組內比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組檢測標本數量

全組3種儀器各檢測274例標本（每例抽取2份等量全血，抗凝），HbA1c含量為4.3%～12.8%，其中3例微粒色譜法檢測HbA1c無讀取結果（親和層析法顯示糖化血紅蛋白總量＞19%），其他數據均在儀器可讀范圍之內，故3例標本作廢。實際檢測患者例數為134例，其中 HbA1c≤ 6.5%的患者38例，6.5% ＜HbA1c含量＜7.5%的患者45例，HbA1c含量≥7.5%的患者51例。

2.2 HbA1c濃度測定結果

采用3種不同的方法在HbA1c含量≤6.5%的人群、6.5%＜HbA1c含量＜7.5%的人群、HbA1c≥7.5%的人群中檢測HbA1c的濃度，經方差分析組內比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3種方法測定HbA1c含量組內比較（%）

2.3 3種不同方法測定HbA1c之間的相關性

采用SPSS 20.0統計軟件將HPLC法所測HbA1c含量為目標值與微粒色譜法、層析法所測HbA1c含量為試驗值進行一元線性回歸后，微粒色譜法與HPLC法數據分析的相關回歸方程為Y=1.006 X+0.213，相關指數r2=0.885；層析法與HPLC法數據分析的回歸方程Y=0.923 X+0.338，相關指數r2=0.917。微粒色譜法、層析法與HPLC法所測數據存在良好的相關性。見圖1。

圖1 3種方法測定HbA1c的相關性比較

2.4 HbA1c回歸分析

在3組不同HbA1c含量≤6.5%、6.5%＜HbA1c含量＜7.5%、HbA1c含量≥7.5%人群中，采用SPSS 20.0統計軟件將HPLC法所測HbA1c含量為目標值，與微粒色譜法、層析法所測數據為試驗值分別進行一元線性回歸后，數據顯示對不同的糖尿病人群，3種方法檢測結果呈現良好的相關性。回歸方程見表2。回歸散點圖見圖2～4。

3 討論

糖尿病的發病機制尚未完全明了。血糖易受飲食、運動、時間、情緒的影響，而且只能反映患者即時的血糖水平和當時的身體狀況。因此，臨床上血糖不作為評價疾病控制程度的標準。GHb是血紅蛋白與葡萄糖結合后的產物占全部血紅蛋白的比例，HbA1c是紅細胞中血紅蛋白與葡萄糖緩慢、持續且不可逆進行非酶促蛋白糖化反應的產物[4]。HbA1c的最大優勢在于其不受血糖濃度即時波動的影響，根據HbA1c含量可推算出測定前8～12周的平均血糖水平[5-6]。2010年，在美國糖尿病協會發布的《糖尿病診療指南》中，已將HbA1c含量＞6.5%優先作為診斷糖尿病的標準[7]。因此，國內學者也逐漸將HbA1c的檢測作為篩選、診斷、監控糖尿病人群的有效指標[8-9]。

表2 不同人群用3種方法測定HbA1c含量的回歸分析

圖2 HbA1c含量≤6.5%人群用3種方法測定HbA1c含量的相關性比較

圖3 6.5%＜HbA1c含量＜7.5%人群用3種方法測定HbA1c含量的相關性比較

圖4 HbA1c含量＞7.5%人群用3種方法測定HbA1c含量的相關性比較

本研究隨機選取了我院內分泌門診和在內分泌病區住院的137例2型糖尿病患者為研究對象，為了保證試驗的合理性、減少誤差以及獲得更多檢測的樣本，共獲得274份標本（每例抽取2份等量全血，EDTA-K2抗凝），涵蓋了＞23歲各年齡段的人群，病史包括初發糖尿病患者，又有糖尿病病史長達51年的患者。僅3例患者血清采用NycoCard readerⅡ床旁HbA1c分析儀（微粒色譜法）的數據無法讀取，超過了該系統測量線性范圍的3%～18%。其他標本均被儀器接受，將3對標本移除后有效標本為268例。根據HPLC法測定的糖化血紅蛋白值將患者分為3組：HbA1c含量≤6.5%的患者38例；6.5%＜HbA1c含量＜7.5%的患者45例；HbA1c含量≥7.5%的患者51例，分組的標準是基于2010年美國糖尿病學會將HbA1c作為診斷糖尿病的標準，診斷切點確定為6.5%[8，10]。研究結果顯示：①各組人群采用3種不同的檢測手段，所得數據組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），3種檢測方法所測結果一致、可靠。②全組利用微粒色譜法所測HbA1c數據與HPLC法有良好的相關性，Y= 1.006 X+0.213，相關指數r2=0.885。親和層析法與HPLC法測定結果亦呈良好的線性關系Y=0.923 X+ 0.338，相關指數r2=0.917，說明本試驗從對象的篩選、血標本的采集、血標本的儲存、血漿的分離以及整個檢驗過程合理、可信。③在不同HbA1c含量的人群中，3種方法檢測結果之間呈現良好的相關性。當然，3種檢測方法亦存在微小偏差（相關指數達到0.999以上為完全相關），但仍顯示相關良好，可被臨床接受，證實糖化血紅蛋白的濃度大小不影響3種儀器的檢測結果。

3種檢測方法各有優缺點：①臨床上普遍認為HPLC法測定HbA1c準確、可靠，是檢測HbA1c的金標準，相關的儀器設備價格昂貴，基層醫院普及困難。而且HPLC法操作復雜、成本高、測定時間長，需將標本收集起來成批檢測，醫生和患者無法得到即時的檢測報告，不利于門急診及臨床科室危急患者病情的監測[11]。②新型的 NycoCard readerII床旁 HbA1c分析儀檢測儀已通過歐洲糖化血紅蛋白參比實驗室（ERL）的鑒定和美國FDA的認證，儀器價格低廉。其采用微粒色譜法，操作簡便、全血量5 μL、檢測速度僅需4～5 min，能滿足基層醫院門急診或臨床科室的使用。從本組的測量結果看，與HPLC法的檢測結果一致，組間比較差異無統計學意義。③親和層析法檢測的是糖化血紅蛋白總量，亦需成批檢測，檢測結果與HPLC法比較差異無統計學意義，亦可作為糖尿病監測的理想方法[12-13]。

研究顯示，血糖與HbA1c呈正相關，HbA1c越高表明血糖與血紅蛋白結合的就越多，病情沒有得到很好的控制[14-16]。HbA1c雖然反映了一個階段的平均血糖水平，但它并不能代替每日飲食前后的血糖監測，醫生根據患者的病史、飲食、運動等情況結合即時的血糖水平調整藥物，HbA1c結合血糖的監測，可以為糖尿病患者指導更加適合的診療方案并給出個體化的健康指導。如果單純地將HbA1c作為診斷糖尿病的診斷依據仍有明顯的不足[17]，血液透析、慢性溶血性貧血、脾功能亢進的患者則不能單用HbA1c的檢測結果判定是否診斷為糖尿病。所以，HbA1c檢測時需詢問病史，排除慢性疾病的影響。有學者建議，如果糖尿病患者血糖近期控制得很好，血糖平穩在5.5～6.5 mmol/L，那么每年可檢測2～3次HbA1c；而對于那些正在進行胰島素治療的患者或近期血糖控制不穩定的患者，建議3～4個月進行一次HbA1c檢測[18]。

本研究證實了新型的床旁HbA1c分析儀測定HbA1c的可靠性，微粒色譜法、親和層析法可作為高效液相色譜測定HbA1c的有效補充。其操作簡單、快捷，適合門、急診及床旁患者快速檢測。

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Analysis on the consistency and reliability of glycated hemoglobin tested by three different methods

JING Danqing CHEN Yujing YIN Shinan JIA Zhe
Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China

Objective To discuss the consistency and reliability of Glycated hemoglobin determined by particles of chromatography,affinity chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC)method.Methods 137 diabetics received ambulatory treatment or hospitalized in the First Affiliated Hospital of PLA General Hospital from June 2014 to September 2014 were selected as research objects,they were drew fasting double whole blood sample. Particles of chromatography,affinity chromatography and HPLC method was separately used to determine glycated hemoglobin A1(HbA1c).Each specimen was measured twice.Taking HbA1ctest by HPLC as gold standard,137 diabetics were divided into three groups:group one(HbA1clevel≤6.5%),group two(6.5%＜HbA1clevel＜7.5%)and group three (HbA1clevel≥ 7.5%).Whether there was statistical difference among three groups was analysed.Taking HbA1ctest by Bio-Rad D10 HPLC method as target system,particles of chromatography and affinity chromatography as testing systems,regression equation was established,the degree of deviation between the results of target system and testing system was analysed.Results There was no significant difference in results of HbA1c among 3 methods(P＞0.05).Regression analysis showed that two methods had a good linear relationship between particles of chromatography and HPLC method,Y=1.006 X+0.213,r2=0.885;There was also a good linear relationship between affinity chromatography and HPLC method,Y=0.923 X+0.338,r2=0.917.The results of three methods showed good correlation to different diabetics.Conclusion Both particles of chromatography and affinity chromatography can offer reliable data of small deviation for clinic,compared to HPLC method.The results can be accepted by clinic.Particles of chromatography is simple and fast to operate,which can provide convenience for clinical rapid diagnosis.

Glycated hemoglobin;Ionic exchange high performance liquid chromatography;Particles of chromatography;Affinity chromatography

R331.1+41

A

1673-7210（2015）11（c）-0091-04

2015-08-06本文編輯：趙魯楓）

解放軍總醫院科研課題項目（201405）。

荊丹清（1971-），女，醫學博士，副主任醫師，主要從事糖尿病、甲亢、骨質疏松等內分泌疾病的診治。