乙肝病毒X基因對肝癌Bel7402細胞ras基因表達的影響

魯 琰 李 偉 朱明月 董 栩 陳 栘 張雪兒 李孟森，4

1.海南醫學院海南省腫瘤發生和干預重點實驗室，海南海口 571199；2.海南醫學院分子生物學重點實驗室，海南海口 571199；3.海南醫學院13卓越創新班，海南海口 571199；4.海南醫學院腫瘤研究所，海南海口 570102

乙肝病毒X基因對肝癌Bel7402細胞ras基因表達的影響

魯 琰1，2李 偉1，2朱明月1，2董 栩1，2陳 栘1，2張雪兒3李孟森1，2，4

1.海南醫學院海南省腫瘤發生和干預重點實驗室，海南海口 571199；2.海南醫學院分子生物學重點實驗室，海南海口 571199；3.海南醫學院13卓越創新班，海南海口 571199；4.海南醫學院腫瘤研究所，海南海口 570102

目的探討乙肝病毒X基因（HBx）對人肝癌細胞原癌基因ras表達水平的影響。方法將pcDNA3.1載體與HBx基因連接構建真核表達載體pcDNA3.1-HBx，采用脂質體介導轉染人肝癌細胞Bel7402，以轉染空載體pcDNA3.1的Bel7402細胞為對照，于轉染后2、4、8、16 h收集細胞，提取細胞總蛋白并用Western blot技術檢測肝癌細胞內n-Ras蛋白表達水平。結果與轉染空載體pcDNA3.1的Bel7402對照組相比，轉染重組表達載體pcDNA3.1-HBx的Bel7402細胞Ras蛋白表達水平在第2小時明顯降低，第4小時Ras蛋白的表達水平仍有降低趨勢，但比第2小時表達量有所增加；第8小時和第16小時，Ras蛋白的表達水平與對照組相比明顯升高，差異有統計學意義 （P＜0.05）。 結論HBx對人肝癌Bel7402細胞Ras蛋白表達有明顯影響，HBx持續表達可能對Ras表達有促進作用。

肝癌；乙肝病毒X基因；Ras

肝癌（HCC）是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，50%以上的肝癌患者分布在中國內地[1]，肝癌已經成為我國嚴重的健康問題。HBV感染是促進肝癌形成的主要誘因，其相關性高達80%[2]。近年來研究顯示，作為乙肝病毒X基因的表達產物（HBx）具有廣泛的反式激活功能，其能通過直接或間接的蛋白質間相互作用參與感染肝細胞的信號轉導、細胞凋亡和細胞周期調控等過程，在肝細胞癌發生和發展過程中發揮著重要作用[3-4]。

惡性腫瘤的形成、進展和轉移與癌基因、抑癌基因不可逆的積累突變和失調有關，其中，ras基因與腫瘤發生發展的關系引起人們較高的關注。有研究表明，ras在肝癌早期已有表達，ras與其他基因如c-myc基因的協同作用在肝細胞癌變過程中發揮重要作用[5-6]。Ras蛋白所介導的轉導途徑是目前研究肝癌發生的熱點問題。Ras蛋白在肝癌旁組織的表達顯著高于HCC組織的表達，并認為Ras蛋白表達陽性的肝細胞具有癌變的潛能。

顧健人等[7]曾證實，n-Ras在肝癌中會過量表達，而蛋白的異常過量表達可能正是腫瘤發生的重要原因。但是，在HBV相關的肝癌中n-Ras表達是否異常，HBx對肝癌細胞中n-Ras的表達是否有影響以及其機制目前還未見相關報道，所以，本實驗試圖將HBx基因轉入肝癌細胞中，在轉染后的不同時間點連續檢測n-Ras蛋白的表達量。通過不同時間點n-Ras蛋白表達量的變化來探討HBx對Ras蛋白表達的影響。為進一步研究HBx對肝細胞增殖信號轉導途徑以及肝細胞癌的惡性侵襲和轉移程度奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細胞系Bel7402購于中國科學院上海細胞庫；特異性鼠抗人n-Ras抗體購于美國Calbiochem公司；HBx抗體購自美國Abcam公司；β-actin抗體和馬抗小鼠的IgG抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 肝癌細胞Bel7402培養于10%胎牛血清的DMEM培養液，在37℃、5%CO2一定飽和濕度環境的條件下連續培養。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。轉染前24 h，用胰酶消化以便收獲對數生長期細胞，以每孔4.0×105個細胞接種于6孔板，37℃5% CO2及一定飽和濕度下培養24 h后轉染。

1.2.2 載體構建及瞬時轉染 設計含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物，擴增長度為482 bp的HBx基因片段，經酶切和連接反應將HBx片段插入pcDNA3.1載體中，構建重組載體pcDNA3.1-HBx；試劑盒提取質粒，雙酶切后電泳鑒定并測序；用脂質體轉染法將構建成功的pcDNA3.1-HBx瞬時轉染Bel7402。

1.2.3 細胞總蛋白提取 分別用磷酸鹽緩沖液漂洗并收集轉染后培養2、4、8、16 h的細胞，3000 r/min離心5 min，棄上清，加入30 μL細胞裂解液及0.3 μL PMSF，冰上靜置裂解30 min，12 000 r/min離心10 min收集上清，用改良的Bradford法進行蛋白定量，-80℃保存備用。

1.2.4 Western blot技術檢測蛋白表達水平的變化

根據蛋白濃度每孔上樣36 μg蛋白，加入上樣緩沖液煮沸5 min。上樣至15%的SDS-PAGE凝膠中，80 V電泳30 min后，120 V電泳60 min。取出凝膠，于轉印液中平衡30 min。4℃40 V轉印3 h至PVDF膜。取出PVDF膜，1×PBS漂洗5 min，室溫封閉2 h。應用特異性抗體HBx（1∶1000稀釋，Abcam，USA）、n-Ras（1∶1000稀釋，Calbiochem，USA）和β-actin（1∶1000稀釋，Santa Cruz，USA）為一抗4℃雜交過夜。用1×PBST漂洗3次，再加入馬抗小鼠的IgG抗體（1∶2000稀釋，Santa Cruz，USA）為二抗，雜交2 h。應用DAB顯色法顯色并掃描成像。以β-actin為內對照，比較轉染HBx后培養不同時間的細胞中HBx和n-Ras蛋白表達水平的變化。

1.3 統計學方法

實驗數據經軟件Graph Pad Prism 5處理，采用SPSS Statistics 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 酶切鑒定結果

插入HBx基因的pcDNA3.1-HBx重組表達載體，如圖1所示，設計含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物，擴增長度為482 bp的HBx基因片段，經酶切和連接反應將HBx片段插入pcDNA3.1載體中，構建重組載體pcDNA3.1-HBx；雙酶切后電泳鑒定，如圖2所示，pcDNA3.1-HBx經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，電泳檢測出現482 bp的HBx片段，說明構建成功。

2.2 轉染pcDNA3.1-HBx載體后HBx在Bel7402細胞中的表達

Western blot檢測結果顯示，Bel7402細胞轉染pcDNA3.1-HBx載體后從轉染的第2小時開始有HBx蛋白表達，且蛋白表達量隨時間遞增（圖3），而轉染空載體的對照組中未見HBx表達。說明pcDNA3.1-HBx載體成功轉染到Bel7402細胞中，并且目的基因HBx在細胞中成功表達。

2.3 Western blot檢測Ras蛋白的表達水平變化

應用Western blot技術，以β-actin作為內參，檢測轉染HBx重組載體和對照空載體后，細胞中Ras蛋白表達水平的變化。結果如圖4所示，在對照組中Ras蛋白的相對表達量在轉染空載體后的第2、4、8、16小時分別為（3.9±0.2）、（4.9±0.2）、（4.6±0.3）和（4.9± 0.2），在轉染空載體后的第2小時Ras蛋白的相對表達量有所下降，但是4 h后Ras蛋白的表達幾乎無變化（P＞0.05）。在肝癌細胞Bel7402中轉染乙肝病毒HBx基因后Ras蛋白在不同時間點表達量明顯不同。第2小時轉染組Ras蛋白的相對表達量為（1.9±0.2），而對照組為（3.9±0.2）；第4小時轉染組Ras蛋白的相對表達量為（3.5±0.18），雖然與第2小時相比，表達量明顯增加，但是仍然低于對照組，這說明轉染HBx后Ras蛋白的表達量在初期是降低的；然而到了第8小時和第16小時，轉染組Ras蛋白的相對表達量分別為（8.2±0.2）和（8.2±0.2），對照組的相對表達量分別為（4.6±0.3）和（4.9±0.2），所以從轉染HBx的第8小時開始Ras蛋白表達量顯著高于對照組（P＜0.05），見圖4，說明在第8、16小時HBx可能誘導Ras蛋白表達增加。

圖1 表達載體結構模式圖

圖2 構建的載體酶切鑒定圖

圖3 HBx在Bel7402中的表達

3 討論

圖4 不同時間點Ras蛋白的表達水平

肝癌的發生發展是一個復雜的多階段、多因素、多基因參與的過程[8-9]。HBVx基因轉錄產物X蛋白是病毒基因的轉錄調節因子，在體外細胞培養時能夠控制和調節病毒基因的表達，干擾宿主細胞生長代謝，影響細胞基因的正常表達而誘發原發性肝癌[10-12]。因此，HBx基因可能在肝癌的發生和發展過程中起著重要作用。

ras基因是第一個被鑒定的人類原癌基因，其表達產物Ras蛋白是一類重要的功能蛋白，其能通過與GDP和GTP結合并水解GTP完成對正常細胞生長信號的傳遞和調節功能[13]，介導生長因子、細胞因子和多種細胞外信號的信息通路，對細胞的增殖、分化和凋亡等多種生理過程發揮重要調節作用[14]。Ras蛋白能通過一系列途徑將生長因子的信號帶入細胞核，激活轉錄因子促進細胞增殖[15]。所以Ras蛋白表達量的異常升高，是腫瘤細胞惡性轉化的標志[14]。有研究發現，ras基因活化后能使鼠NIH/3T3細胞轉化為腫瘤細胞，Ras蛋白與腫瘤的侵襲轉移以及惡性轉化關系非常密切[16]。紀子釗等[17]研究發現，Ras蛋白在肝癌組織的表達顯著高于癌旁組織的表達，且與VEGF、P53等協同表達，與肝細胞癌的惡性程度、侵襲和轉移能力有關。最近Oishi等[18]研究發現，HBx能夠通過與Ras的協同作用來抑制Ras蛋白誘導的衰老，但是具體機制還不明確。

為了研究HBx對肝細胞癌變過程中Ras蛋白表達水平的影響，本研究將重組的HBx載體pcDNA3.1-HBx轉染肝癌細胞Bel7402，提取蛋白后應用Western blot技術來檢測Ras蛋白的表達。結果顯示，肝癌細胞Bel7402轉入HBx基因后的不同時間點，Ras蛋白表達量明顯不同。在轉染后4 h，與對照相比，轉染HBx的細胞Ras蛋白表達量有逐步上升的趨勢；在剛轉染的2 h內，Ras表達有下降現象，這可能是由于在轉染時，pcDNA3.1-HBx載體以及轉染的脂質體對細胞有一定損傷作用，這個作用可能誘導或促進細胞凋亡，導致Ras蛋白的表達量下降，而不是HBx本身的抑制作用。在轉染8、16 h后，細胞穩定表達HBx，這時HBx開始發揮對Ras基因表達的調控作用。本研究結果顯示，與對照組比較，轉染HBx能促進人肝癌Bel7402細胞的Ras蛋白表達，提示在轉染HBx第4小時Ras蛋白的表達量開始升高。

Ras在肝癌的發生過程中發揮重要作用，而肝癌的發生與感染HBV密切相關。近期研究發現，HBx誘導肝細胞惡性轉化過程中也能誘導Ras和其他癌基因的表達從而促進肝細胞的惡性轉化和行為[19-20]。本研究結果提示，HBx可能通過其反式作用因子的轉錄激活作用上調Ras蛋白表達，從而導致生長因子或其他信號傳遞異常，致使細胞惡性轉化，這可能是乙肝病毒誘導肝癌的發病機制之一。由于Ras蛋白能激動生長信號的轉遞，是細胞生長和惡變的重要信息物質，所以實驗結果提示HBx可能通過誘導Ras表達促進細胞惡性轉化。HBx通過何種機制誘導Ras表達目前還不清楚，這是有待進一步研究的科學問題，也是探索HBx誘導肝細胞惡性轉化的關鍵機制。

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The effect of hepatitis B virus X gene on the expression of ras in human hepatoma cells Bel7402

LU Yan1,2LI Wei1,2ZHU Mingyue1,2DONG Xu1,2CHEN Yi1,2ZHANG Xue'er3LI Mengsen1,2,4

1.Hainan Provincial Key Laboratory of Carcinnogenesis and Intervention,Hainan Medical College,Hainan Province, Haikou 571199,China;2.Key Laboratory of Molecular Biology,Hainan Medical College,Hainan Province,Haikou 571199,China;3.The Class 13 Innovation Excellence,Hainan Medical College,Hainan Province,Haikou 571199, China;4.Institution of Tumor,Hainan Medical College,Hainan Province,Haikou 570102,China

Objective To investigate the influence of HBx on proto-oncogene ras expression in human hepatoma cells. Methods HBx linked to pcDNA3.1 for constructing eukaryotic expression vector pcDNA3.1-HBx.pcDNA3.1-HBx vectors were transfected into Bel7402 cells to establish Bel7402/HBx cell model.Bel7402 cells transfected with pcDNA3.1 was used as control.Western blot was applied to evaluate the expression levels of n-Ras in Bel7402 cell while transfected with pcDNA3.1-HBx vectors for 2,4,8,16 h.Results The expression of Ras in Bel7402 was significantly lower while transfected with pcDNA3.1-HBx vectors for 2 h and 4 h contrast with control group (vehicle vector),however,the expression of Ras was significantly promoted while transfected with pcDNA3.1-HBx vectors for 8 h and 16 h（P＜0.05）.Conclusion HBx plays a role in influencing the expression of Ras in Bel7402 cells.Persistent expression of HBx maybe stimulate expression of Ras in hepatoma cells.

Hepatocellular carcinoma;HBx;Ras

R734

A

1673-7210(2015)11(b)-0009-04

2015-06-16本文編輯：程 銘）

國家自然科學基金（81360307、81260306、81160261、31060164）；海南省社會發展科技專項（2015SF03）；海南醫學院科研培育基金（HY2013-19）；海南醫學院大學生創新創業訓練計劃項目（HYCX2014031）。

李孟森（1970-），男，研究員，主要從事腫瘤的發生發展的分子機制以及腫瘤耐藥機制研究。