miRNA-34a靶向抑制Rb/E2F1通路激活增強(qiáng)結(jié)腸癌放療敏感性

金芳玲 蔡忠芳 葛陽麗 張 曉夏 冰

1.浙江省東陽市人民醫(yī)院放療科，浙江東陽 322100；2.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院放療科，浙江杭州 310000

miRNA-34a靶向抑制Rb/E2F1通路激活增強(qiáng)結(jié)腸癌放療敏感性

金芳玲1蔡忠芳1葛陽麗1張 曉1夏 冰2

1.浙江省東陽市人民醫(yī)院放療科，浙江東陽 322100；2.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院放療科，浙江杭州 310000

目的探討MiRNA-34a在結(jié)腸癌細(xì)胞化療敏感性中的作用及機(jī)制。方法構(gòu)建miRNA-34a過表達(dá)的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞，經(jīng)放療處理后，采用氯丁膠新型交聯(lián)劑（MTT）、平板克隆和Western blot檢測miRNA-34a過表達(dá)后對HT29細(xì)胞放療敏感性和Rb/E2F1通路的影響。 結(jié)果慢病毒載體轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞后miRNA-34a表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)[（5.91±1.47）倍]，miRNA-34a組HT29細(xì)胞對放療的敏感性顯著增強(qiáng)，細(xì)胞存活率和克隆形成能力出現(xiàn)顯著下降，Rb蛋白磷酸化和E2F1蛋白表達(dá)水平也受到miRNA-34a過表達(dá)的抑制。結(jié)論miRNA-34a靶向抑制Rb/E2F1通路激活增強(qiáng)結(jié)腸癌放療敏感性，證實(shí)miRNA-34a-Rb/E2F1通路是結(jié)腸癌臨床放射治療相關(guān)的有效分子靶點(diǎn)。

MiRNA-34a；Rb/E2F1通路；放射治療；結(jié)腸癌

結(jié)腸癌（colon cancer）是我國最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)腸癌發(fā)病率位居我國惡性腫瘤第3位，其致死率居第5位，表現(xiàn)出易轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)的特點(diǎn)[1]。輔助治療常用于提高手術(shù)治療的成功率和生存率（主要是化學(xué)藥物和放射治療）。其中放療雖然能夠在短時間內(nèi)導(dǎo)致腫瘤體積縮小甚至消退，但經(jīng)過緩解期后，腫瘤對放療的敏感性下降，從而出現(xiàn)復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移，被稱為放療抵抗。探索有效的分子靶點(diǎn)以增強(qiáng)結(jié)腸癌的放療敏感性已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

微小RNA（micro RNA，miRNA）是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)，長約22個核苷酸，能與特定靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'UTR配對結(jié)合來調(diào)控靶基因表達(dá)的非編碼RNA[2]。已經(jīng)可以明確放療誘導(dǎo)miRNA的差異表達(dá)，如非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在受到放療誘導(dǎo)后，miRNA-34家族能被抑癌基因p53直接轉(zhuǎn)錄生成而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。此外，有研究指出E2F相關(guān)通路是miRNA-34誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的靶標(biāo)蛋白[4]。但對于miRNA-34a在結(jié)腸癌放療敏感性中的作用及其機(jī)制尚未見研究報(bào)道。本研究通過慢病毒過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染來上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)miR-34a的表達(dá)，采用氯丁膠新型交聯(lián)劑（MTT）和細(xì)胞克隆形成探究miRNA-34a表達(dá)水平改變后對結(jié)腸癌細(xì)胞放療敏感性的作用及其對Rb/E2F1通路的調(diào)控作用，為結(jié)腸癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)試劑（DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶）購自美國Gibco公司；TRI-zol試劑和Realtime PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；hsa-miRNA-34a過表達(dá)慢病毒載體和轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑polybrene由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成 （載體為pRI-CMVGFP-miRNA vector）；Western blot相關(guān)試劑（上樣緩沖液，蛋白marker，電泳液和轉(zhuǎn)膜液，顯色液等）購自碧云天公司；第一抗體[兔抗人anti-p-Rb、anti-E2F1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）]和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的第二抗體（羊抗兔）購自Cell signalling Technology公司，其他常用試劑購自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1000 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，放置于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，每2～3天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合＞80%后使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，種板培養(yǎng)或傳代。

1.2.2 miR-34a轉(zhuǎn)染 HT29細(xì)胞培養(yǎng)到密度＞80%后，使用胰蛋白酶消化重懸，加入DMEM完全培養(yǎng)基稀釋到1×105個/mL，取2 mL細(xì)胞種到6孔板中，置于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞融合＞30%后更換無血清培養(yǎng)基，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。使用嘌呤霉素對最佳病毒滴度進(jìn)行篩選，按照1 μg慢病毒載體（pRI-CMVGFP-miRNA 34a vector）/500 μL DMEM的配比混合均勻，加入polybrene（5 μg/mL）增強(qiáng)病毒轉(zhuǎn)染效率，室溫孵育30 min。將混合物加入6孔板中，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染12 h后更換DMEM完全培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 miR-34a表達(dá)檢測 培養(yǎng)HT29細(xì)胞使用QIAGEN公司miRNA提取試劑盒，提取總miRMA后，使用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將上述提取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min；以TaqMan MicroRNA檢測試劑盒對上述制備得到的cDNA進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃15 s及60℃1 min，共40個循環(huán)。PCR完成后，在羅氏LC480軟件上分析基因的擴(kuò)增情況，得到相應(yīng)的Ct值。以U6為內(nèi)參來校正PCR模板的拷貝數(shù)，每組設(shè)3個復(fù)孔，基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，空白對照組為未經(jīng)任何處理的HT29細(xì)胞，陰性對照組為空白病毒載體轉(zhuǎn)染的HT29細(xì)胞，miRNA-34a過表達(dá)組為慢病毒載體（pRI-CMVGFP-miRNA 34a vector）轉(zhuǎn)染的HT29細(xì)胞。

1.2.4 Western blot miRNA-34a過表達(dá)組使用慢病毒載體（pRI-CMVGFP-miRNA 34a vector）轉(zhuǎn)染24 h、陰性對照組使用空白慢病毒載體轉(zhuǎn)染24 h、空白對照組的HT29細(xì)胞不做處理同時培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，加入10 uL的RIPA裂解液，10 min后提取總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，各組取50 μg蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜，用5%milk-TBS將膜封閉1 h，加入相應(yīng)的第一抗體，靜置于4℃過夜。次日使用TBST漂洗，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，顯色拍照。

1.2.5 MTT檢測細(xì)胞的增殖 細(xì)胞分組及處理同“1.2.4”項(xiàng)下，轉(zhuǎn)染后的HT29細(xì)胞密度＞80%后使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按1×106個/孔的密度接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中孵育12 h后，釆用Varian 2300EX直線加速器6MV-X線垂直輻射結(jié)腸癌細(xì)胞（上蓋1 cm有機(jī)玻璃填充物），所用劑量率為3Gy/min，源皮距SSD100cm，照射野10cm×10cm。照射結(jié)束后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。不同時間點(diǎn)內(nèi)按照10 μL/孔的濃度加入MTT試劑，37℃孵育1 h后，酶標(biāo)儀讀取每孔的吸光度值。

1.2.6 細(xì)胞輻射處理后檢測對克隆形成的影響 細(xì)胞分組及處理同 “1.2.4”項(xiàng)下，1×106個/孔的密度接種HT29細(xì)胞于6孔板中，分別給予0、2、4、6、8 Gy劑量的X線輻射，輻射結(jié)束后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)板孔中出現(xiàn)明顯的結(jié)腸癌細(xì)胞克隆時，去除培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，烘箱烘干后，光學(xué)顯微鏡計(jì)算視野內(nèi)克隆數(shù) （＞50個細(xì)胞），計(jì)算公式如下：克隆形成率（planting efficiency，PE）=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%；存活分?jǐn)?shù)（surviving fraction，SF）受照射細(xì)胞的克隆形成率/對照細(xì)胞的克隆形成率×100%。運(yùn)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行L-Q模型和多IE單擊模型曲線擬合，繪制劑量存活曲線，計(jì)算增敏比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-34a轉(zhuǎn)染增強(qiáng)HT29細(xì)胞內(nèi)miRNA-34a表達(dá)

在miRNA-34a的慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞24 h后，圖1的GFP熒光檢測結(jié)果可見，miRNA-34a轉(zhuǎn)染和陰性對照組的HT29細(xì)胞中可見GFP綠色熒光蛋白，表明慢病毒轉(zhuǎn)染成功。提取HT29細(xì)胞總miRNA進(jìn)行Real time PCR驗(yàn)證，陰性對照組（NS）的miRNA-34a表達(dá)水平為（1.02±0.07）倍，轉(zhuǎn)染后的HT29細(xì)胞的miRNA-34a表達(dá)水平增加到 （5.91± 1.47）倍；陰性對照組與空白對照組的miRNA-34a表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此可以明確，miRNA-34a表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞后能夠顯著上調(diào)miRNA-34a的表達(dá)。見表1。

圖1 空白對照組、陰性對照組和miRNA-34a過表達(dá)組的HT29細(xì)胞的熒光照片

表1 Realtime PCR檢測空白對照組、陰性對照組和miRNA-34a過表達(dá)組的HT29細(xì)胞的miRNA-34a表達(dá)水平（）

表1 Realtime PCR檢測空白對照組、陰性對照組和miRNA-34a過表達(dá)組的HT29細(xì)胞的miRNA-34a表達(dá)水平（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01

組別 miR-34a mRNA表達(dá)水平空白對照組陰性對照組miRNA-34a過表達(dá)組1.00 1.02±0.07 5.91±1.47*

2.2 miRNA-34a過表達(dá)增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的放療敏感性

采用MTT法對miRNA-34a過表達(dá)后HT29細(xì)胞對體外放療敏感性的改變進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，使用3 Gy/min劑量率垂直輻射結(jié)腸癌細(xì)胞后，miRNA-34a過表達(dá)組的生長曲線從培養(yǎng)的第3天開始出現(xiàn)顯著差異，miRNA-34a過表達(dá)后的HT29細(xì)胞生存分?jǐn)?shù)要顯著低于空白對照組，其中在第6天空白對照組的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)為 （43.76±3.23）%，miRNA-34a過表達(dá)組細(xì)胞的生存率為（13.2±3.19）%（P＜0.01）；陰性對照組的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)為 （41.57±3.10）%，miRNA-34a過表達(dá)組細(xì)胞的生存率為（13.2±3.19）%（P＜0.01）。表明miRNA-34a過表達(dá)組的細(xì)胞對射線的敏感性要明顯高于對照組細(xì)胞。見圖2。

圖2 miRNA-34a過表達(dá)前后HT29細(xì)胞對放療敏感性的變化

2.3 miRNA-34a過表達(dá)抑制放療處理結(jié)腸癌細(xì)胞的克隆形成

結(jié)腸癌細(xì)胞的克隆形成檢測結(jié)果顯示經(jīng)過放療處理后，miRNA-34a過表達(dá)HT29細(xì)胞的單個細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于對照細(xì)胞，不同劑量組的克隆數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，miRNA-34a過表達(dá)顯著抑制放療處理結(jié)腸癌細(xì)胞的克隆形成。采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算放射增敏比=1.533。見表2。

表2 兩組不同劑量X線照射后克隆形成率和存活分?jǐn)?shù)比較（）

表2 兩組不同劑量X線照射后克隆形成率和存活分?jǐn)?shù)比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

0 Gy克隆形成率（%）組別 存活分?jǐn)?shù)（%）2 Gy克隆形成率（%）存活分?jǐn)?shù)（%）4 Gy克隆形成率（%）存活分?jǐn)?shù)（%）6 Gy克隆形成率（%）存活分?jǐn)?shù)（%）8 Gy克隆形成率（%）存活分?jǐn)?shù)（%）空白對照組miRNA-34a組72.2±5.3 66.4±1.3 100.0 100.0 45.3±8.7 32.3±1.2 56.3 45.6 22.7±0.9 10.4±0.1*21.2 12.1 12.9±0.3 1.5±0.5**10.9 8.7*5.6±0.1 0.1±0.0**2.3 0.1**

2.4 miRNA-34a過表達(dá)抑制Rb磷酸化水平和E2F1蛋白表達(dá)

最近的研究顯示Rb/E2F1蛋白是miRNA-34a調(diào)控的關(guān)鍵靶分子。Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組比較，miRNA-34a過表達(dá)組的p-Rb和E2F1蛋白條帶灰度明顯降低，但空白對照組和陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3），使用Image Pro Plus6.0的條帶分析結(jié)果如圖4所示，以GAPDH表達(dá)量作為蛋白定量分析內(nèi)參，miRNA-34a過表達(dá)組的p-Rb和E2F1蛋白表達(dá)水平明顯降低（與空白對照組比較，P＜0.01；與陰性對照組比較，P＜0.01），表明miRNA-34a可能通過抑制Rb磷酸化水平和E2F1蛋白表達(dá)而增強(qiáng)HT29細(xì)胞的放療敏感性。

3 討論

圖3 Western blot檢測空白對照組、陰性對照組和miR-34a過表達(dá)組的HT29細(xì)胞中p-Rb和E2F1蛋白表達(dá)(GAPDH用作內(nèi)參)

圖4 Image Pro Plus 6.0分析Western blot檢測條帶的光密度(以GAPDH表達(dá)量作為蛋白定量分析內(nèi)參)

隨著放療技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，其已成為結(jié)腸癌輔助治療的有效手段之一。但是在臨床使用中由于癌細(xì)胞對放療敏感性的降低，導(dǎo)致療效降低和結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。為增強(qiáng)癌細(xì)胞的放療敏感性，一方面通過開發(fā)新型的放療技術(shù)或治療方案以達(dá)到最佳的輔助治療效果，另一方面，通過分子生物技術(shù)揭示癌細(xì)胞的放療抵抗機(jī)制以用于臨床。隨著蛋白組學(xué)和高通量技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，后者的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用成為可能[5-6]。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為人體內(nèi)最大種類的表達(dá)調(diào)控因子，在人體細(xì)胞內(nèi)具有多種生物功能，包括參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等，尤其是miRNA在癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用更是成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[7]。已有研究者證實(shí)在結(jié)腸癌患者體內(nèi)miRNA表達(dá)譜已經(jīng)出現(xiàn)顯著差異，并且對其中差異化表達(dá)明顯的miRNA進(jìn)行初步篩選，證實(shí)miRNA表達(dá)與結(jié)腸癌的治療和預(yù)后存在顯著相關(guān)[8]。而且已經(jīng)有多項(xiàng)研究明確，癌細(xì)胞在受到放射治療后，會導(dǎo)致miRNA表達(dá)變化[9]。例如Wang等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞受到放射刺激后，多種miRNA表達(dá)異常，其中miRNA-21過表達(dá)能夠促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞的凋亡。miRNA-34a是一種最近鑒定的與多種癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNA。例如，Yan等[11]發(fā)現(xiàn)miRNA-34a能夠通過下調(diào)c-Met表達(dá)而抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，此外也有多項(xiàng)研究證實(shí)miRNA-34a與癌細(xì)胞的耐藥性相關(guān)[12-13]。為進(jìn)一步闡明miRNA-34a在結(jié)腸癌放療中的作用，本研究構(gòu)建miRNA-34a過表達(dá)的慢病毒載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，通過Real time PCR證實(shí)轉(zhuǎn)染成功導(dǎo)致miRNA-34a的表達(dá)顯著上調(diào)，并通過功能學(xué)研究揭示了miRNA-34a過表達(dá)后結(jié)腸癌HT29細(xì)胞對X線照射的敏感性增強(qiáng)，表現(xiàn)在細(xì)胞增殖能力和存活分?jǐn)?shù)下降上，克隆形成能力受到miRNA-34a抑制。此外，還發(fā)現(xiàn)miRNA-34a增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的放療敏感性可能與Rb/E2F1通路相關(guān)，表現(xiàn)在miRNA-34a過表達(dá)后HT29細(xì)胞內(nèi)Rb磷酸化和E2F1表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)，這與相關(guān)研究[13-14]的結(jié)果一致。

然而，在癌細(xì)胞的增殖分化和侵襲轉(zhuǎn)移中，往往存在多種基因網(wǎng)絡(luò)或信號通路的共同參與，例如在miRNA-34a相關(guān)的調(diào)控通路中也不僅是Rb/E2F1通路，還有研究報(bào)道TREM2、SIRT2等多種蛋白的表達(dá)也受到miRNA-34a的調(diào)控[15-16]，因此還需要對結(jié)腸癌中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行深入研究，具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

綜上所述，本研究對miRNA-34a在結(jié)腸癌放療敏感性中的作用進(jìn)行了初步闡明，并對其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了檢測，推動結(jié)腸癌放療抵抗“miRNA-靶基因”作用模式的發(fā)展，為放療技術(shù)和方案的發(fā)展提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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miRNA-34a increases the radiotherapy sensitivity of colon cancer by targeting Rb/E2F1 pathway

JIN Fangling1CAI Zhongfang1GE Yangli1ZHANG Xiao1XIA Bing2

1.Department of Radiotherapy,the People's Hospital in Dongyang City of Zhejiang Province,Dongyang 322100,China; 2.Department of Radiotherapy,the Frist People's Hospital in Hangzhou City of Zhejiang Province,Hangzhou 310000, China

Objective To investigate effect and mechanism of miRNA-34a in the chemosensitivity of colon cancer cells.Methods Lentiviral vector for miRNA-34a overexpression was constructed and transfected into human colon cancer cell line HT29 cells.After radiation treatment,the radiosensitivity of HT29 cell was determined by MTT and colony.Rb/E2F1 pathway was measured by Western blot.Results miRNA-34a expression in lentiviral vector-transfected HT29 cells increased to (5.91±1.47)folds.The sensitivity of miRNA-34a overexpression of HT29 cells to radiotherapy was enhanced by miRNA-34a overexpression.The cell viability and clonogenic capacity were inhibited by miRNA-34a.Rb protein phosphorylation and E2F1 protein expression were also inhibited by overexpression of miRNA-34a.Conclusion miRNA-34a enhances radiation sensitivity of colon cancer by the inhibition of Rb/E2F1 pathway, confirming that miRNA-34a-Rb/E2F1 pathway is associated with colorectal cancer radiation therapy as an effective molecular target.

miRNA-34a;Rb/E2F1 pathway;Radiation therapy;Colon cancer

R735.3+3

A

1673-7210(2015)11(b)-0013-05

2015-04-19本文編輯：趙魯楓）

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y13H160069）。