時差成像技術在常規體外受精周期中單原核胚胎的原核形成和卵裂模式及對其發育潛能的應用

招 霞 王珊珊 蔣益群 張寧媛 孫海翔

南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖醫學中心，江蘇南京 210008

時差成像技術在常規體外受精周期中單原核胚胎的原核形成和卵裂模式及對其發育潛能的應用

招 霞 王珊珊 蔣益群 張寧媛 孫海翔▲

南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖醫學中心，江蘇南京 210008

目的 通過時差成像系統（TLI）觀察常規體外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期中單原核胚胎的發育特征，探討原核形成方式、卵裂模式與囊胚形成的關系，評估單原核胚胎的發育潛能。 方法選取2013年10月～2015年3月在南京鼓樓醫院生殖醫學中心行常規體外受精（IVF）周期患者的單原核胚胎的175個周期胚胎行TLI動態觀察，對其中228個單原核胚胎進行囊胚培養，回顧性分析胚胎的原核形成方式、卵裂模式和囊胚形成結局。 結果原核形成方式上，10.09%（23/228）的胚胎的單原核為2個原核融合而成，其他胚胎始終只觀察到1個原核。卵裂模式上，21.93%（50/228）胚胎卵裂模式正常，異常的卵裂模式包括非軸性卵裂、不均卵裂、非二倍性卵裂、卵裂球碎裂、發育停滯及未卵裂，其中非二倍性卵裂和卵裂球碎裂較為多見，17.11%（39/228）單原核胚胎有可移植囊胚評分＞ⅣCC，7.46%（17/228）的胚胎形成的囊胚評分≥ⅣBB。原核形成方式上，2個原核融合為1個原核的單原核胚胎的可移植囊胚形成率顯著高于始終為1個原核者；卵裂模式上，可移植囊胚均來源于卵裂模式正常及僅發生非軸性卵裂的胚胎，其可移植囊胚形成率分別為66.00%和46.15%，而其他卵裂模式異常的胚胎無可移植囊胚形成。結論常規IVF周期的單原核胚胎具有一定的發育潛能，單原核胚胎的發育潛能與其原核形成方式和卵裂模式密切相關，2個原核融合為1個原核的單原核胚胎和卵裂模式正常者及僅發生非軸性卵裂者具有較高的可移植囊胚形成率。當患者無可移植的雙原核胚胎時，可將2個原核融合為1個原核的單原核胚胎納入選擇范圍，卵裂模式亦有助于篩選具有發育潛能的單原核胚胎，對正常及僅發生非軸性卵裂的單原核胚胎進行移植或冷凍，以提高卵子利用率。

單原核胚胎；時差成像；原核形成；卵裂模式；體外受精；胚胎發育

在體外受精-胚胎移植 （in-vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）周期中,觀察常規體外受精（IVF）或卵子胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）后的卵子在受精后16～18 h的狀態，具有兩個原核為正常受精，而多個原核和單原核被認為是異常受精。異常受精的胚胎由于染色體可能存在異常而容易導致胚胎著床失敗和自然流產，一般不用于移植，降低胚胎利用率。IVF和ICSI后單原核胚胎的發生率為3%～6%[1]，單原核胚胎是否具有發育潛能，能否用于移植或冷凍尚無定論。研究顯示[2-4]，常規IVF周期中48.7%～61.9%的單原核胚胎為二倍體，提示常規IVF周期中單原核胚胎具有一定的可利用價值。

近來研究發現，胚胎發育的動態參數與胚胎活力和染色體是否正常有關，可用來評估胚胎質量，預測其發育潛能。而某些動態參數在傳統觀察方式下無法記錄，近年興起的時差成像系統（time-lapse imaging，TLI）將攝像裝置與培養箱結合，在培養箱內每間隔一定時間對胚胎進行自動攝像，形成胚胎發育全過程的動態影像。TLI克服了傳統胚胎觀察的弊端，在保證胚胎培養環境穩定的同時，對胚胎發育進行更加全面和細致的記錄。一些與胚胎發育潛能密切相關的生物學特征，如原核的形成及消失、卵裂時間及同步性等已經幫助胚胎學家更為有效地評價胚胎質量。Meseguer等[5]大樣本回顧性研究證明，應用TLI觀察的動態參數挑選胚胎與傳統方法相比臨床妊娠率可提高約20%。目前對TLI技術應用于胚胎評估的研究主要集中于時間參數[6-7]。Athayde等[8]研究表明，TLI可以識別形態學正常而卵裂模式異常的胚胎，如1個卵裂球直接分裂為3個卵裂球的異常卵裂，而非整倍體或基因異常是誘發胚胎異常卵裂的主要原因，如將此類胚胎進行移植，可導致流產率升高，提示卵裂模式對胚胎發育結局具有重要影響。

本研究將常規IVF周期患者的胚胎通過TLI系統進行培養和觀察，對其中單原核胚胎培養至囊胚期，回顧性分析其卵裂模式和囊胚形成情況的關系，以此評估卵裂期單原核胚胎的發育潛能，指導臨床患者單原核胚胎的利用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究于2013年10月～2015年3月在南京鼓樓醫院生殖醫學中心（以下簡稱“我院”）進行，對有單原核胚胎的175個周期資料進行回顧性分析。患者納入標準：①常規IVF周期；②女方年齡≤40歲；③周期數≤2；④月經第3天促卵泡激素（FSH）≤12 U/mL；⑤常規長方案促排卵[9]；⑥獲卵數為5～15。患者排除標準：①完全或部分受精失??；②卵子異常。采用短時受精，去除顆粒細胞后置于TLI中，培養至囊胚期。將受精后16～18 h原核數目為1個的單原核胚胎作為研究對象，記錄其原核形成方式、卵裂模式及囊胚形成情況。本研究通過我院倫理委員會 （No.2013068）審批，所有患者夫妻雙方簽署知情同意書。

1.2 TLI系統

本研究采用Primo Vision TLI（Vitrolife，Sweden）時差成像系統[10]，此系統在傳統培養箱內配置倒置胚胎顯微鏡，通過數據線與培養箱外的控制臺主機相連接，胚胎置于專用9孔集合培養皿中培養，每孔放置1個胚胎，具有明確的位置標記，拍照頻率為5 min/次，直至胚胎發育至第6天。

1.3 IVF與胚胎培養

卵子取出后置于IVF(Vitrolife，瑞典)培養微滴中，37℃、6%CO2的培養箱中培養。獲卵3 h后加精，加精比例為10 000條精子/卵子。采用短時受精方法，精卵共孵育6 h后機械剝離顆粒細胞，置于倒置顯微鏡下觀察第二極體是否形成，以判斷卵子是否受精。受精卵子數目超過總卵數60%的患者被認為受精成功。患者胚胎在判斷受精成功后即轉入含有G1（Vitrolife，瑞典）培養液的WOW培養皿中，置于TLI系統中進行胚胎培養和觀察。第3天胚胎移植后，其余胚胎按照相同位置轉入含有G2（Vitrolife，Sweden）的WOW皿中進行囊胚培養至第6天。

1.4 囊胚分級

對形成囊胚者根據ALPHA/ESHRE指南對其質量進行分級[11]。根據囊胚的擴張和孵出程度將其分為Ⅰ～Ⅵ級，根據內細胞團（inner cell mass，ICM）和滋養層（trophectoderm，TE）的質量分為A～C級。本研究中在第5天或6天將囊胚分級＞ⅣCC者定義為可移植囊胚，≥ⅣBB者定義為優質囊胚。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胚胎觀察及其卵裂模式的定義

通過TLI動態觀察單原核胚胎發育，記錄胚胎的卵裂模式。胚胎的卵裂模式包括正常卵裂和異常卵裂，其中異常卵裂模式包括不均、非軸性卵裂、非二倍性卵裂、發育停滯及卵裂球碎裂。見表1。

2.2 患者一般資料與胚胎發育情況

在175個周期中觀察到單原核胚胎共228個。患者年齡為（31.75±3.21）歲，體重指數為（22.54±3.02）kg/m2，基礎FSH為（6.89±1.84）mU/mL，平均獲卵數為（10.96± 3.17）個，正常受精率為72.71%，正常卵裂率為98.55%，可移植囊胚形成率為17.11%，優質囊胚形成率為7.46%。

表1 胚胎主要的異常卵裂模式定義及圖示

2.3 單原核胚胎原核形成方式與囊胚形成

少部分單原核胚胎的1個原核為2個原核融合而成，大部分胚胎始終只觀察到1個原核。單原核直徑在22～32 μm，平均（27.13±2.54）μm。在原核后期原核直徑增大，之后消失。原核由2個原核融合而成的單原核胚胎與始終只有1個原核的胚胎相比，具有較高的可移植囊胚形成率及優質囊胚形成率，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

1個單原核胚胎的原核由2個原核融合而成，胚胎在原核形成初期為2個原核，之后兩個原核相互靠近融合，在受精16～18 h觀察時，表現為1個原核。此胚胎分裂模式和發育速度同雙原核胚胎，即從受精卵分裂為2個細胞，在第2天發育為4個細胞，在第3天發育為8個細胞，在第5天發育為囊胚。見圖1。

表2 單原核胚胎原核形成方式與囊胚形成[n=228，n（%）]

2.4 單原核胚胎卵裂模式與囊胚形成

圖1 單原核胚胎的發育

單原核胚胎中，少部分胚胎卵裂模式正常，大部分胚胎卵裂模式出現異常，其中非二倍性卵裂和卵裂球碎裂較為多見，其次為發育停滯和未卵裂，再次為非軸性卵裂和不均卵裂。可移植囊胚僅來源于卵裂模式正常及發生非軸性卵裂的胚胎。卵裂模式正常的胚胎可移植囊胚形成率和優質囊胚形成率最高，其次為僅發生非軸性卵裂的胚胎。而不均、非二倍性卵裂、發育停滯及卵裂球碎裂這些卵裂模式異常的胚胎無可移植囊胚形成。見表3。

表3 胚胎卵裂模式與囊胚形成[n=228，n（%）]

3 討論

受精是精卵相互協調發育的復雜過程，是輔助生殖技術中的首要環節。卵子取出后停滯于第2次減數分裂的中期，待精子進入后繼續減數分裂，排出含有染色質的第二極體，繼而出現分別來自母方和父方的兩個原核，這是正常受精的標志。原核的形成可發生在受精后3～20 h，大部分正常受精的合子在受精后16～18 h表現為兩個原核。這個結論是基于卵子是成熟的，在受精時已完成第1次減數分裂。然而，有些卵子可能是正常受精，但是由于成熟過程延遲而表現為無原核或單原核[12]。單原核來源的胚胎能否用于移植一直為胚胎學家所困擾，目前單原核胚胎通常不作為移植胚胎的首選。

在早期IVF工作中，單原核合子被認為是由化學、機械刺激引起的孤雌生殖，而非精子進入的受精，卵胞漿內精子注射（ICSI）術后的單原核多是這一來源，機械刺激激活了卵母細胞。然而，隨著基因檢測技術的發展，在單原核合子中檢測到Y染色體的存在，證實單原核的胚胎有受精的發生，這在常規IVF周期中較為常見。Porter等[13]應用熒光原位雜交技術對常規IVF來源的單原核胚胎進行檢測，結果顯示54.35%胚胎為二倍體，且50%有Y染色體，這個結果遠高于ICSI來源的單原核胚胎 （10%～34.62%）。Staessen等[3]與Sultan等[4]得到了與Porter等[13]相似的結果，IVF中單原核胚胎的二倍體比例為48.7%～61.9%。除了孤雌生殖，目前認為單原核的形成機制包括：雌雄原核發育的非同步性，導致兩個原核形成或消失不一致，當在某一時間點觀察時，僅見單個原核存在、雌雄原核形成障礙及雌雄原核的異常融合[14]。后者包括雌雄原核形成一個共用的核膜或者在原核形成之初為兩個原核，之后融合成大的單個原核。有些單原核合子由于核膜結構異常，始終沒有第二原核出現。囊胚培養是對胚胎染色體狀態進行自然篩選的有效方法[15]，對于人類胚胎，胚胎基因組決定胚胎形成8個細胞之后的發育。如果胚胎染色體正常，胚胎基因組正常激活，則胚胎在8個細胞之后順利發育到囊胚階段的可能性較高。因此，囊胚形成與否及其質量反映了胚胎的染色體狀態和發育潛能。研究表明二倍體的單原核胚胎發育成囊胚的比例較高,我院生殖醫學中心數據顯示[16]，女方年齡＜35歲的常規IVF周期中，單原核胚胎≥ⅣBC囊胚的形成率為11.90%。目前有移植單原核胚胎分娩出健康新生兒的報道[17-18]，因此認為IVF單原核胚胎具有一定的可利用價值。

在IVF臨床工作中，對于無雙原核來源的優質胚胎可用的患者，如果將優質單原核胚胎加以利用，可避免周期取消，提高卵子利用率。怎樣預測單原核胚胎的發育潛能，在不破壞胚胎的前提下最大限度地排除染色體異常的胚胎是目前亟待解決的問題。目前胚胎的觀察和篩選大多采用傳統的胚胎觀察方式，即在胚胎發育的數天中僅在某幾個時間點對胚胎進行觀察，其中原核的形成、消失、胚胎的卵裂模式等動態信息僅通過片面的靜態的胚胎形態觀察無法得知。近年來興起的IFN系統可在穩定可控的環境中對胚胎發育進行高頻率的觀察和記錄，形成胚胎發育的連續影像。應用這種先進的胚胎觀察模式，我們可捕捉胚胎發育過程中的動態變化，通過分析胚胎的發育特征，尋找與囊胚形成具有密切關系的動力學參數，對于預測胚胎的發育潛能具有重要的指導意義。

本研究將單原核胚胎培養至囊胚階段，囊胚形成結果顯示單原核胚胎整體可利用率為17.11%。為進一步預測胚胎發育潛能，筆者應用TLI系統對胚胎的發育特征進行動態觀察和分析，發現單原核胚胎的囊胚形成與其原核形成方式及卵裂模式密切相關。原核形成方式上，2個原核融合為1個原核的單原核胚胎的可移植囊胚形成率和優質囊胚形成率顯著高于始終為1個原核的單原核胚胎，說明2個原核融合為1個原核的單原核胚胎擁有雌雄2個原核的比例較高，從而具有較高的發育潛能。傳統的原核觀察僅在受精后16～18 h對原核觀察1次，無法判斷單個原核是否為2個原核融合而成，TLI系統的應用則有助于觀察原核的形成方式和動態變化，識別原核的真正個數，進而預測胚胎的囊胚形成情況和發育潛能。在卵裂模式上，只有卵裂模式正常及僅有非軸性卵裂的胚胎有發育為可移植囊胚的可能，其可利用比例分別為66.00%和46.15%。卵裂模式異常包括不均、非二倍性卵裂、發育停滯及卵裂球碎裂的單倍體胚胎無可移植囊胚形成。不均在胚胎發育中的較為常見，有研究顯示[19-20]，不均胚胎的非整倍體率和卵裂球多核率顯著高于均一胚胎（29.4%比8.5%、21.1%比2.1%）。胚胎非二倍性卵裂可能與染色體異常相關[21]，Athayde等[22]發現此類胚胎具有較低的囊胚形成率（11.7%）及種植率（3.7%）。發育停滯的胚胎亦多為非整倍體胚胎[23]，發育潛能低下，以上均與本研究結果一致。

綜上所述，單原核胚胎具有一定的發育潛能，原核的形成方式和胚胎的卵裂模式與其發育潛能相關。傳統的胚胎觀察方法無法對以上現象做出觀察，而應用TLI系統可通過記錄胚胎的原核形成方式和胚胎的卵裂模式預測胚胎的發育潛能。2個原核融合為1個原核的單原核胚胎和卵裂模式正常及僅發生非軸性卵裂的單原核胚胎具有較高的可移植囊胚形成率。對于獲卵數較少或該周期中沒有可移植的雙原核胚胎患者，可通過TLI系統的觀察，將2個原核融合為1個原核的單原核胚胎納入選擇范圍。TLI系統觀察到的卵裂模式亦有助于篩選具有發育潛能的單原核胚胎，選擇卵裂模式正常及僅發生非軸性卵裂的單原核胚胎進行移植和冷凍，以提高卵子利用率。發育潛能較好的單原核胚胎與雙原核胚胎在染色體和基因上的正常率有無差異，尚需進一步研究證實。

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Study of the pronucleus formation and cleavage pattern of embryos de-rived from mononuclear oocytes after conventional in-vitro fertilization by time-lapse imaging and evaluation of the developmental potential

ZHAO Xia WANG Shanshan JIANG Yiqun ZHANG Ningyuan SUN Haixiang▲
Department of Reproductive Medicine Center,the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School,Jiangsu Province,Nanjing 210008,China

Objective To observe the developmental characteristic of embryos derived from mononuclear oocytes after conventional in-vitro fertilization (IVF)by time-lapse imaging(TLI),investigate the relationship of the pronucleus formation,the cleavage patterns and formation rates of blastocyst,and evaluate the developmental potential of mononuclear oocytes.Methods A retrospective study was performed to analyze the 228 mononuclear oocytes embryos of 175 conventional IVF treatment cycles using TLI from October 2013 to March 2015 in Reproductive Medicine Center of the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School.The pronucleus formation,cleavage patterns and blastocyst formation were analysed.Results There were 10.09%（23/228）embryos whose mononuclear were formed by the fusion of two pronuclei.The other embryos remained mononuclear throughout.21.93%（50/228）embryos had normal cleavage pattern.The abnormal cleavage patterns included non-axial cleavage,uneven cleavage,non-diploid cleavage, fragmented blastomere,developmental arrest and no cleavage,among which non-axial cleavage and fragmented blastomere were more common.17.11%（39/228）embryos derived from mononuclear oocytes formed good-quality(＞ⅣCC),7.46%（17/228）embryos formed blastocyst whichgrade reached or were greater thanⅣBB.The embryos whose mononuclear was formed by the fusion of two pronuclei have higher transferable blastocyst formation rates than the embryos remained mononuclear throughout.All the transferable blastocysts were developed from mononuclear oocytes with normal cleavage or non-axial cleavage,which the transferable blastocyst formation rates were 66.00%and 46.15%individually.Embryos with other abnormal cleavages had no transferable blastocyst formation.Conclusion Part of embryos after conventional IVF derived from mononuclear oocytes have the chance of forming blastocyst,the developmental potential is closely related to their pronucleus formation and cleavage patterns.Embryos whose mononuclear are formed by the fusion of two pronuclei and embryos with normal cleavage or non-axial cleavage have higher transferable blastocyst formation rates.When there are no good embryos derived from two pronucleus oocytes for transfer,the embryos whose mononuclear are formed by the fusion of two pronuclei can be considered.Cleavage pattern helps to distinguish the potentiality of embryo development.The mononuclear oocytes embryos with normal cleavage or non-axial cleavage can be selected for transplantation or cryopreservation to improve the utilization rate of oocytes.

Mononuclear oocytes;Time-lapse imaging;Pronucleus formation;Cleavage pattern;In-vitro fertilization; Embryo development

R329.1

A

1673-7210(2015)11(b)-0074-06

2015-06-25本文編輯：關 婧）

江蘇省省級條件建設與民生科技專項資金項目（BL2014003）。

▲通訊作者