食道鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁組織中sonic hedgehog和patched1的表達(dá)

張 滿 崔宏偉 師迎旭 楊 凌

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

食道鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁組織中sonic hedgehog和patched1的表達(dá)

張 滿1崔宏偉2師迎旭3楊 凌2

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

目的在食道鱗狀細(xì)胞癌和配對(duì)癌旁組織中檢測(cè)sonic hedgehog（SHH）和patched1（PTCH1）的表達(dá)。 方法選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科2012～2014年經(jīng)手術(shù)切除、病理科確診為食道鱗狀細(xì)胞癌的標(biāo)本共30例及其癌旁組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)SHH和patched1的表達(dá)。結(jié)果在30例食道鱗狀細(xì)胞癌組織中10例（33.3%）PTCH1陽(yáng)性表達(dá)，腫瘤組織中未檢測(cè)到SHH蛋白的表達(dá)，癌旁組織中未見兩種蛋白的表達(dá)。PTCH1的表達(dá)與患者吸煙、飲酒，食道鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤分化、分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）。 結(jié)論 SHH的表達(dá)不是激活hedgehog通路的原因。

食道鱗狀細(xì)胞癌；癌旁組織；Sonic hedgehog；Patched1

食道癌是全球范圍內(nèi)癌癥導(dǎo)致死亡中排名第六的疾病。我國(guó)食道鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率占全世界總和的70%[1]。食道鱗狀細(xì)胞癌在我國(guó)因腫瘤死亡的疾病中排名第四[2]。食道癌在組織學(xué)上有兩種主要的類型：鱗狀細(xì)胞癌和腺癌這兩種亞型在不同的地區(qū)有不同的發(fā)病率：在世界范圍內(nèi)食道鱗狀細(xì)胞癌是主要的食道癌類型，而在美國(guó)腺癌的發(fā)病率幾乎和美洲白人的鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率一樣高[3]。由于大多數(shù)的食道癌在晚期被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致其高死亡率。發(fā)現(xiàn)和鑒定靈敏的、特異性高的食道癌分子標(biāo)志物將有助于早期診斷和發(fā)展對(duì)晚期食道癌患者的高效的靶向性治療。

作為一個(gè)重要的發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路，hedgehog信號(hào)通路對(duì)維持組織極性和干細(xì)胞群體起到重要作用。hedgehog通路組分也在多種上皮腫瘤中持續(xù)有活性，包括肺癌，胰腺癌，其他胃腸道腫瘤和前列腺癌[4-10]。為了更好地闡明hedgehog信號(hào)激活在食道癌發(fā)生和發(fā)展過程的作用，本研究檢測(cè)了hedgehog靶基因patched1（PTCH1）和配體蛋白sonic hedgehog（SHH）在食道鱗狀細(xì)胞癌中及配對(duì)的癌旁組織中的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科2012～2014年經(jīng)手術(shù)切除、病理確診為食道鱗狀細(xì)胞癌患者30例的標(biāo)本及其癌旁組織，其中男25例，女5例，年齡42～79歲，平均年齡為（61.4±9.2）歲。所有患者術(shù)前均未行放化療治療，病理類型為鱗狀細(xì)胞癌，其中高～中分化20例，低分化10例，分期Ⅱ級(jí)21例，Ⅲ級(jí)9例。另選擇距腫瘤邊緣2 cm處經(jīng)病理證實(shí)為正常組織的食道黏膜作為對(duì)照。所有患者均知情同意，且研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)

標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，切厚度為5 μm片，烤片備用。根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒Universal Quick Kit（美國(guó)VECTOR公司）步驟，應(yīng)用S-P免疫組化二步法，使用底物試劑盒VECTOR NOVARED Substrate Kit顯色，脫水，透明和封片后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。SHH抗體、PTCH1抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞以出現(xiàn)紅色顆粒為陽(yáng)性。對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)是隨機(jī)取5個(gè)高倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值。免疫組織化學(xué)得分（0、0.5、1、1.5、2、3分）是由染色強(qiáng)度（0分：沒有染色；1分：輕微染色；2分：中度染色；3分：重度染色）乘以染色密度（0分：陽(yáng)性細(xì)胞比例＜10%；0.5分：陽(yáng)性細(xì)胞比例10%～30%；1分：陽(yáng)性細(xì)胞比例＞30%）。染色的結(jié)果分為陰性（免疫組織化學(xué)得分=0）和陽(yáng)性（免疫組織化學(xué)得分＞0）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用Fisher確切概率χ2檢驗(yàn)，配對(duì)計(jì)數(shù)資料的比較采用Fisher確切概率法McNemar檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

PTCH1在10例 （33.3%）的腫瘤組織有陽(yáng)性表達(dá)，而在正常的食道組織中無PTCH1的表達(dá) （P＜0.01）（圖1，見封四）。在腫瘤組織中組織無SHH的表達(dá)。進(jìn)一步分析顯示PTCH1的表達(dá)與吸煙，飲酒不相關(guān)（P＞0.05）（表1），說明吸煙或是飲酒可能不是直接引起hedgehog通路激活的原因。PTCH1表達(dá)與食道鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤分化、分期或是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）（表1）。

表1 食道鱗狀細(xì)胞癌臨床資料與PTCH1蛋白表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

hedgehog信號(hào)通路的主要傳導(dǎo)機(jī)制從果蠅到人類是相對(duì)保守的。七次跨膜蛋白smoothened（SMO）是該途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，另一個(gè)跨膜蛋白Patched（PTCH）在沒有hedgehog配體的情況下會(huì)抑制 SMO的功能。在有 hedgehog配體的情況下，hedgehog和它的受體PTCH結(jié)合，釋放PTCH對(duì)SMO的抑制，SMO傳導(dǎo)信號(hào)最終到Gli轉(zhuǎn)錄因子。作為轉(zhuǎn)錄因子，Gli通過與靶基因的起始區(qū)特異序列直接結(jié)合來調(diào)控其表達(dá)。有報(bào)道在幾種食道癌細(xì)胞系和食道癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)SHH和信號(hào)通路靶基因的表達(dá)增加[10-12]。Gli的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)的深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后差相關(guān)[11]。研究還表明進(jìn)行放化療的患者Gli在細(xì)胞核表達(dá)要比Gli在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的患者的預(yù)后差[13]。

在我國(guó)食道鱗狀細(xì)胞癌是食道癌主要的亞型。在食道鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)高頻率的myc基因擴(kuò)增和偶爾的kras基因的突變。且在食道鱗狀細(xì)胞癌中cyclinD1的表達(dá)上升是很普遍的[14-15]。本研究收集了30例食道鱗狀細(xì)胞癌和癌旁組織。結(jié)果顯示，鱗狀細(xì)胞癌組織中PTCH1的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P＜0.01），提示食道鱗狀細(xì)胞癌表現(xiàn)出分子水平上的異質(zhì)性。但是30例食道鱗狀細(xì)胞癌組織中，只在10例（33.3%）腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)PTCH1的陽(yáng)性表達(dá)，低于Zhang等[16]報(bào)道的104例食道鱗狀細(xì)胞癌中60%GLi1的陽(yáng)性表達(dá)，分析其原因可能是①實(shí)驗(yàn)中的食道鱗狀細(xì)胞癌的取材的地區(qū)不同；②檢測(cè)的通路分子不同，本研究中檢測(cè)的通路靶基因?yàn)镻TCH1，Zhang等[16]的研究中鑒定的通路靶基因?yàn)镚Li1；③本實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)本例數(shù)較少。事實(shí)上，食道鱗狀細(xì)胞癌中已報(bào)道的各種分子變化的頻率都不高。所以在分子水平上對(duì)食道鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)行分類需要更多的研究，包括在更大的范圍內(nèi)研究每一例腫瘤的多個(gè)分子的變化。

已有的研究表明hedgehog信號(hào)通路的活性與SHH的表達(dá)的升高相關(guān)[12]。在本次研究中，沒有發(fā)現(xiàn)SHH的表達(dá)。這些結(jié)果說明本次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本例數(shù)較少或是hedgehog通路中其他的變化導(dǎo)致了信號(hào)通路的激活。其可能的機(jī)制有Indian hedgehog的表達(dá)升高，信號(hào)通路負(fù)調(diào)節(jié)子的過甲基化[如HIP，Su（Fu）]，信號(hào)通路下游分子基因的擴(kuò)增（如Gli轉(zhuǎn)錄因子）。有研究表明胃癌、食道癌和直腸癌中HIP啟動(dòng)子的過甲基化導(dǎo)致HIP的表達(dá)下降[17]。在肺癌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)由于過甲基化而導(dǎo)致Su（Fu）基因的沉默[18]。盡管每個(gè)組織中hedgehog信號(hào)通路激活的原因需要進(jìn)一步的研究，然而SHH的表達(dá)提高并不是激活hedgehog通路的唯一機(jī)制。基于這些發(fā)現(xiàn)，可以預(yù)測(cè)對(duì)于hedgehog通路激活的食道癌的治療策略要具體情況具體對(duì)待。例如，對(duì)于過表達(dá)SHH而引發(fā)hedgehog通路激活的腫瘤可以用SHH中和抗體或是SMO拮抗劑來治療；對(duì)于Gli1或是Su（Fu）分子變化而引發(fā)的腫瘤可以用Gli1的抑制劑來治療；而對(duì)于hedgehog通路沒有激活的腫瘤用hedgehog通路抑制劑來治療可能沒有任何作用。

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Expression of sonic hedgehog and patched1 in esophageal squamous cell carcinomas and adjacent tissues

ZHANG Man1CUI Hongwei2SHI Yingxu3YANG Ling2

1.Department of Thoracic Surgery,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Huhhot 010050,China;2.Clinical Medical Research Center,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Huhhot 010050,China;3.Department of Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Huhhot010050,China

Objective To examine expression of sonic hedgehog(SHH)and patched1(PTCH1)in esophageal squamous cell carcinomas and paired adjacent tissues.Methods From 2012 to 2014,in Department of Thoracic Surgery,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,30 samples from esophageal squamous cell carcinomas and paired adjacent tissues diagnosed by pathologist were selected,expression of SHH and PTCH1 were detected by immunohistochemistry method.Results Among 30 esophageal squamous cell carcinomas tissues,10 cases (33.3%)had patched1 positive expression,no expression of SHH was detected in tumor tissues,no expression of PTCH1 and SHH was detected in adjacent tissues.Statistical analysis revealed that PTCH1 expression was not associated with smoking, drinking,differentiation,stage and lymph node metastasis of cancer(P＞0.05).Conclusion Expression of sonic hedgehog is not the reason for activation of the hedgehog pathway.

Esophageal squamous cell carcinoma;Adjacent normal tissues;Sonic hedgehog;Patched1

R735.1

A

1673-7210(2015)11(b)-0091-03

2015-07-02本文編輯：蘇 暢）

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013MS1129）；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院一般科研項(xiàng)目（NYFYYB2014012）。

張滿（1984-），男，碩士；研究方向：胸部腫瘤臨床及基礎(chǔ)研究。

楊凌 （1981-），女，博士；研究方向：腫瘤中hedgehog通路研究。