瘢痕疙瘩及其成纖維細胞p16基因甲基化狀態和相關基因表達研究

季江 冷紅 冀勝軍 蘇玉華 施辛 田野 曹建平

瘢痕疙瘩及其成纖維細胞p16基因甲基化狀態和相關基因表達研究

季江 冷紅 冀勝軍 蘇玉華 施辛 田野 曹建平

目的 探討瘢痕疙瘩中成纖維細胞p16基因甲基化在其發生發展中的作用。方法 分離、培養來自瘢痕疙瘩皮損和健康人皮膚原代成纖維細胞；免疫組化法檢測瘢痕疙瘩皮損中p16表達情況；實時熒光定量PCR檢測瘢痕疙瘩成纖維細胞中p16、DNA甲基轉移酶mRNA表達；亞硫酸氫鹽修飾后測序（BSP法）檢測瘢痕疙瘩皮損及培養的原代成纖維細胞p16基因甲基化狀態。結果 瘢痕疙瘩成纖維細胞中p16基因mRNA表達低于健康人皮膚成纖維細胞（相對表達量2-ΔΔCt分別為0.64±0.18和1.92±0.23，t=10.54，P<0.05）。瘢痕疙瘩成纖維細胞三種DNA甲基轉移酶（DNMT）基因mRNA表達水平（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B分別為2.58±0.23、4.87±0.46、1.57±0.12）與健康人皮膚成纖維細胞（分別為1.13±0.21、2.38±0.32、0.57±0.16）相比均存在高表達，兩組比較，t值分別為11.22、10.81、12.45，均P<0.05。瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩原代成纖維細胞內p16啟動子區甲基化程度分別為1.81%±0.46%和3.15%±0.94%，明顯高于健康人皮膚組織（0.90%±0.35%，F=14.23，P<0.01）和原代成纖維細胞（0.17%±0.29%，F=37.62，P<0.01）。結論 瘢痕疙瘩成纖維細胞中p16基因甲基化及其低表達與瘢痕疙瘩的失控性生長可能相關，DNA甲基轉移酶在其發病中可能起一定作用。

瘢痕疙瘩；成纖維細胞；基因，p16；甲基化；甲基轉移酶類

瘢痕疙瘩是遺傳易感性患者皮膚損傷后組織異常修復的結果。因其所具備的持續性生長、切除后易復發和向健康皮膚侵襲生長的臨床特點，目前作為一種腫瘤而進行研究［1］。其主要功能細胞瘢痕疙瘩成纖維細胞（KFb）不受正常細胞周期控制時，增殖超過凋亡。此種平衡關系的改變可能與基因的結構和功能異常有關，多個基因表達及其相互之間信息傳遞與調控上的某種異常可能是引起成纖維細胞過度增殖和膠原過度合成的重要原因［2］。我們的研究表明，瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖能力強于健康人皮膚成纖維細胞（待發表），細胞周期也存在異常，因此有必要進一步檢測瘢痕疙瘩皮損及KFb細胞周期相關基因表達情況，并對啟動子區甲基化狀態、DNA甲基轉移酶（DNMT）的基因表達情況進行研究。

材料和方法

一、標本來源

本研究經蘇州大學附屬第二醫院倫理委員會批準。標本取自整形美容外科和皮膚科手術治療的患者，并征得患者書面同意。入選標準：經臨床和組織病理檢查確診的瘢痕疙瘩患者，病程超過1年，皮損超過傷口范圍，呈浸潤持續生長，有發紅、癢、痛等臨床癥狀；未經手術、激光、冷凍、糖皮質激素皮損內注射等治療。排除標準：正常瘢痕、增生性瘢痕、年齡大于60歲的患者。健康人標本取自美容手術無相應疾病患者。

二、瘢痕疙瘩皮損組織病理和p16免疫組化檢測

將標本以4%甲醛固定、石蠟包埋，常規制備免疫組化石蠟切片。免疫組化（Envision二步法）檢測按試劑盒說明書操作。實驗結果依據成纖維細胞陽性細胞數及染色強弱評分，即先按陽性細胞比例將無、0～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分別計為0、1、2、3、4分；再按染色強度將無、弱、中、強分別計為0、1、2、3 分，最后綜合兩部分得分即為總分。每張切片由2名病理醫師分別采用半定量系統評價，所有結果都在雙盲法下判定。

三、瘢痕疙瘩患者皮損及健康人皮膚原代成纖維細胞（分別簡稱KFb和NFb）的分離、培養和鑒定

局麻下切取瘢痕疙瘩皮損組織或健康人皮膚標本，去除皮下脂肪組織，置中性蛋白酶（Dispase II 2 U/ml，德國羅氏試劑）、膠原酶（200 U/L）（美國Sigma公司）溶液中，37℃水浴4 h，分離表真皮；將分離的真皮剪碎，放入膠原酶（200 U/L）溶液中，37℃水浴3 h，消化分散、收集成纖維細胞液，加一定量的完全培養液，200目篩網過濾，收集過濾的細胞懸液，低速離心；洗后細胞種植于50ml培養瓶，加入含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L

采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學處理。計量資料以±s表示，采用t檢驗和單因素方差分析（One-way ANOVA）進行顯著性檢驗，兩組間比較采鏈霉素的DMEM培養基（美國Gibco公司），置37℃5%CO2培養箱中進行原代培養；2～3 d換液1次，待梭形成纖維細胞布滿瓶底時，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化細胞并傳代增殖。以下所有實驗選用第4～7代細胞。原代成纖維細胞采用免疫熒光鑒定，4%多聚甲醛固定，加0.3%Tritonx-100破細胞膜，血清封閉，加入鼠抗人波形蛋白（美國Abcam公司）一抗孵育2 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后加入羊抗鼠熒光二抗孵育1 h，最后再進行DAPI復染核，熒光顯微鏡觀察。陰性對照不加一抗。

四、p16和DNMT基因表達檢測

取KFb和NFb，利用Trizol法提取總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA第1鏈。PCR反應體系為：SYBR Green 1 Mix（ferment）10μl、上游引物 1μl、下游引物 1μl、待測樣品 cDNA 1μl和 ddH2O 7μl。利用SYBR Green法，在ABI 7500實時定量PCR儀上進行PCR擴增。PCR反應條件為：93℃2min預變性，然后按93℃1min，55℃1min，72℃1min，共40個循環，最后72℃7min延伸。實驗中各產物的片段長度、引物序列見表1。采用2-ΔΔCt方法分析結果，對于每個基因，計算兩組之間基因表達倍數改變。

表1 PCR引物序列表

五、p16基因啟動子區甲基化狀態檢測

p16基因（CDKN2A）有38個CpG島。采用重亞硫酸鹽修飾后克隆測序PCR（bisulfite sequencing PCR，BSP），根據序列設計并合成1對BSP引物，對需要分析的片段進行PCR擴增，通過藍白斑篩選，挑選5個白色的克隆接種于3ml LB（Luria-Bertani）液體培養基中；質粒小量提取試劑盒（Axygen，美國santacruze公司）提取質粒，并送上海英拜生物科技有限公司測序；在http://quma.cdb.riken.jp/網站上對各樣本測序結果進行甲基化程度分析。

六、統計學處理

用最小顯著差法（Least Significant Difference,LSD）。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、臨床資料

瘢痕疙瘩患者12例，男女各6例；年齡12～49（34.78±9.83）歲；病程 16～110（35.68±12.72）個月；瘢痕疙瘩主要分布在前胸、肩背、頸項、耳廓等。健康人對照組12例，男5例，女7例；年齡18～42（38.09±6.34）歲。兩組的性別構成比及年齡差異均無統計學意義（P＞0.05）。

二、皮損組織病理和免疫組化檢測

所有入選者組織均經病理檢查，HE染色證實為瘢痕疙瘩組織或者健康人皮膚組織。p16免疫組化結果示，健康人皮膚真皮內成纖維細胞胞核呈陽性（圖1A），而瘢痕疙瘩組織呈陰性（圖1B），僅個別汗腺細胞p16染色陽性。健康人皮膚和瘢痕疙瘩組織免疫組化評分值分別為3.92±1.08和1.75±0.75，兩組比較，t=5.69，P<0.001。

圖1 瘢痕疙瘩組織和健康人皮膚p16免疫組化染色 1A：健康人皮膚組織（×100）；1B：瘢痕疙瘩組織（×40）。健康人皮膚可見真皮內成纖維細胞的胞核染色陽性，呈棕色顆粒；而瘢痕疙瘩組織陰性，僅個別汗腺細胞p16染色陽性（箭頭）

三、原代成纖維細胞的分離、培養和鑒定

消化分離的成纖維細胞可在體外快速貼壁生長、增殖，約2周左右原代細胞鋪滿瓶底，胞體細長呈長梭形，核卵圓形居中，細胞呈柵欄狀、漩渦狀生長。免疫熒光染色顯示，培養的細胞核呈藍色，卵圓形，胞質呈綠色紅色熒光，波形蛋白表達陽性。

四、實時定量PCR技術檢測p16和DNMT基因的表達

實時定量PCR檢測KFb和NFb中p16基因的表達和p16甲基化調控相關基因 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B表達的變化，相應熔點曲線Tm值分別為89.15、87.04、80.95 和 87.60。KFb中 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表達分別為2.58±0.23、4.87±0.46、1.57±0.12，明顯高于NFb（分別為1.13±0.21、2.38±0.32、0.57±0.16），兩組比較，t值分別為11.22、10.81、12.45，均P<0.05。而KFb中p16基因mRNA表達低于 NFb（分別為0.64±0.18和 1.92±0.23，t=10.54，P<0.05）。

五、BSP檢測p16基因啟動子區甲基化狀態

瘢痕疙瘩皮損組織、KFb原代細胞DNA經重亞硫酸鹽結合后進行PCR檢測，成功擴增出451 bp的目的片段（圖2）。原代培養的KFb和NFb各6例，瘢痕疙瘩組織和健康人皮膚組織各10例行BSP檢測（圖3）。測序結果顯示，瘢痕疙瘩組織和KFb內p16啟動子區甲基化程度分別為1.81%±0.46%和3.15%±0.94%，明顯高于健康人皮膚組織（0.90%±0.35%，F=14.23，P<0.01）和 NFb（0.17%±0.29%，F=37.62，P<0.01）。

圖2 瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩原代皮膚成纖維細胞p16啟動子區PCR結果M：標準參照物；1～10：分別為瘢痕疙瘩組織標本；11～16：分別為瘢痕疙瘩原代皮膚成纖維細胞。PCR產物為451 bp

圖3 瘢痕疙瘩原代皮膚成纖維細胞和健康對照原代皮膚成纖維細胞BSP檢測p16基因啟動子甲基化結果 每個圓圈代表1個CG，黑圈代表甲基化，白圈代表未甲基化；每1行代表該樣本的1個克隆測序結果中所有的CG，每份樣本5個克隆；右側為CG甲基化檢測陽性率。K1～K3：為瘢痕疙瘩原代皮膚成纖維細胞；N1～N3：為健康對照原代皮膚成纖維細胞

討 論

瘢痕疙瘩在臨床表現上與腫瘤有很多相似之處，以較多的膠原沉積為其特征。新型的抗腫瘤藥物，如表觀遺傳調控藥物、甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（AZA）、組蛋白脫乙酰酶（HDAC）抑制劑曲古菌素A，已在實驗研究中證實能有效治療瘢痕疙瘩［3-5］，說明瘢痕疙瘩是具有一定腫瘤特性的病變。但瘢痕疙瘩不具備腫瘤的轉移特性，在病理學方面也有較大區別，并不具有腫瘤的異形性、核分裂、增殖能力。

腫瘤的特征是不平衡的甲基化。在腫瘤中，伴隨基因組低甲基化的是區域性的高甲基化及DNA甲基化轉移酶基因高表達［6-7］。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式，能在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現，由DNMT催化S腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5甲基胞嘧啶（mC），在真核生物DNA中，5甲基胞嘧啶是唯一存在的化學性修飾堿基［8-9］。CpG島的甲基化模式具有種屬和組織特異性，至少由3種DNMT相互作用后形成，包括維持哺乳類動物DNA甲基化的DNMT1，有重新甲基化活性的DNMT3a和DNMT3b。我們的研究發現，KFb 3種DNMT mRNA表達均高于NFb，提示DNMT對瘢痕疙瘩的甲基化進程起一定作用。有文獻報道［10］認為，DNMT與瘢痕疙瘩的浸潤生長以及進行性生長存在密切聯系，提示瘢痕疙瘩存在異常的甲基化狀態。有研究表明，采用甲基轉移酶抑制劑AZA可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖及促進凋亡，而對正常皮膚的成纖維細胞無明顯影響［11］。

前期研究表明，KFb在細胞增殖及DNA合成代謝等多個方面均明顯高于NFb；細胞周期檢測表明，KFb存在G2/M期阻滯［12-13］。p16基因又名多腫瘤抑制基因1（MTS1），其基因編碼產物P16蛋白可通過與細胞周期依賴性激酶（CDK）4結合而使其失活，從而阻止細胞由G1期進入S期，抑制細胞的過度增殖。p16基因啟動子區域的高甲基化使基因沉默，P16蛋白不能表達［14-15］。我們的研究發現，瘢痕疙瘩皮損及其成纖維細胞p16基因低表達，其啟動區CpG島中存在甲基化現象，但甲基化程度與腫瘤細胞相比還存在較大差異［16］。

綜上，我們的研究表明，瘢痕疙瘩中主要的功能細胞成纖維細胞在DNA甲基轉移酶的作用下，出現表觀遺傳學相關改變，p16基因啟動子區呈現甲基化狀態，影響該基因的表達，繼而可能出現細胞周期、細胞增殖異常，表現相應臨床癥狀。

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2014-06-11）

（本文編輯：顏艷）

Methylation status of p16 gene and expressions of related genes in keloid tissue and cultured keloid fibroblasts

Ji Jiang,Leng Hong,Ji Shengjun,Su Yuhua,Shi Xin,Tian Ye,Cao Jianping.Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China

Tian Ye,Email:dryetian65@hotmail.com

ObjectiveTo explore the role of p16 gene methylation in fibroblasts in the occurrence and development of keloid.MethodsSkin tissue specimens were resected from the lesions of patients with keloid and normal skin of healthy human controls.Fibroblasts were isolated from these tissue specimens and subjected a primary culture.An immunohistochemical analysis was performed to measure the expression of p16 protein in tissue specimens,real-time fluorescence-based quantitative PCR to determine the mRNA expression level（expressed as 2-△△Ct）of p16 and DNA methyltransferases（DNMTs）in fibroblasts,and bisulfite sequencing PCR（BSP）to estimate the methylation status of p16 gene in the tissue specimens and primary fibroblasts.ResultsThe keloid fibroblasts （KFbs） showed significantly lower mRNA expression of p16 gene（0.64±0.18 vs.1.92±0.23,t=10.54,P<0.05）,but significantly higher mRNA expressions of 3 DNMTs（DNMT1:2.58±0.23 vs.1.13±0.21,t=11.22,P<0.05;DNMT3A:4.87±0.46 vs.2.38±0.32,t=10.81,P<0.05;DNMT3B:1.57±0.12 vs.0.57±0.16,t=12.45,P<0.05）compared with the normal fibroblasts （NFbs）.The DNA methylation rate in the p16 gene promoter region was significantly increased in keloid tissue（1.81%±0.46%）and KFbs（3.15%±0.94%）compared with normal skin tissue（0.90%±0.35%,F=14.23,P<0.01）and NFbs （0.17%±0.29%,F=37.62,P<0.01）.ConclusionsThe methylation and low expression of p16 gene in KFbs may be associated with the uncontrolled growth of keloid,and DNMTs may play a role in the pathogenesis of keloid.

Keloid;Fibroblasts;Genes,p16;Methylation;Methyltransferases

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.007

國家自然科學基金（81172128、81402517）；江蘇省放射醫學與防護重點實驗室開放課題（KJS1244）；江蘇省臨床醫學科技專項（BL2014040）

215004蘇州大學附屬第二醫院皮膚科［季江（Email：drjiangji@gmail.com）、冷紅、蘇玉華、施辛］，腫瘤放療科（冀勝軍、田野）；蘇州大學醫學部放射醫學與公共衛生學院（曹建平）

田野，Email：dryetian65@hotmail.com