Cbl-b基因shRNA干擾載體的構建及鑒定

胡彬 倪娜娜 呂雅琳 陳浩 劉毅 孫建方

Cbl-b基因shRNA干擾載體的構建及鑒定

胡彬 倪娜娜 呂雅琳 陳浩 劉毅 孫建方

目的 構建小鼠Cbl-b基因RNA干擾（RNAi）的真核表達質粒，并初步鑒定其干擾效果，為后續研究Cbl-b在黑素瘤免疫治療中的作用奠定基礎。方法 根據基因庫提供的Cbl-b cDNA序列，設計并合成4對短發夾結構的互補DNA序列，克隆至載體PGPU6/GFP/Neo構建重組質粒，并予以DNA測序鑒定。重組干擾質粒構建成功后，將干擾質粒與Cbl-b過表達載體共轉染293T細胞，于轉染后48 h，通過實時熒光定量PCR法及蛋白質印跡法檢測各質粒對Cbl-b基因的表達抑制效應。結果 測序分析證實，4對shRNA寡核苷酸序列分別成功插入至shRNA真核表達載體PGPU6/GFP/Neo中，將構建成功的PGPU6/GFP/Neo-shRNA質粒與Cbl-b真核表達載體共轉染細胞48 h后，通過熒光實時定量PCR法及Western印跡測定，發現4條shRNA序列對Cbl-b的表達均有一定的抑制效應，其中以1號shRNA序列重組質粒對Cbl-b表達的抑制程度最高（P＜0.05）。結論 成功構建并篩選出沉默效應最高的Cbl-b shRNA真核細胞表達載體。

泛素蛋白連接酶類；RNA，小分子干擾；黑色素瘤；基因，Cbl-b

Cbl-b屬于泛素連接酶E3家族中的成員，近年的研究發現，其直接參與了T細胞的活化及免疫耐受過程，是體內介導T細胞免疫無能的內源性調節因子之一［1-2］。我們應用RNA干擾技術，參照Cbl-b CDS區序列，設計了4條siRNA候選序列，并據此設計了其相應的發夾狀shRNA序列，構建shRNA真核表達載體，然后通過細胞轉染實驗，篩選出對Cbl-b沉默效率最高的shRNA表達載體。

一、試劑與材料

1.試劑：載體pGPU6/GFP/Neo（上海吉瑪制藥技術有限公司）；pdsRed1-N1-cb1b過表達質粒由本室構建；DH5α感受態細胞（北京全式金生物公司）；293T細胞（中國科學院上海生化與細胞所）；DMEM培養基、Opti-MEM培養基、胎牛血清（美國 Gibco公司）；脂質體 LipofbctamineTM2000、Trizol Reagent（美國Invitrogen公司）；SYBR實時熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司）；Cbl-b的單克隆抗體（sc-8006）（美國Santa Cruz公司）；HRP標記的IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；PCR引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；其余為國產分析純。

2.實驗儀器與設備：CO2細胞培養箱（美國Thermo Scientific公司）；ABI7300實時熒光定量 PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；低溫離心機、醫用超低溫冷凍箱、酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；凝膠成像及分析裝置，聚丙烯酰胺凝膠電泳儀，聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳槽，微型轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；超純水儀（美國Millipore公司）。

二、方法

1.Cbl-b基因shRNA表達模板序列設計及合成：針對Cbl-b的CDS區設計并合成了針對不同靶位點的siRNA序列，并根據siRNA序列設計合成相應的shRNA序列。在shRNA中的循環結構選擇TTCAAGAGA，避免終止信號的形成，轉錄終止信號選用T6結構。shRNA正向鏈的5′添加CACC序列，與Bbs I酶切后形成的粘末端互補；反向鏈的5′添加了GATC，與BamH I酶切后形成的粘末端互補。如果siRNA的第1個堿基不是G，則在CACC序列后補加1個G。另設計隨機序列作為陰性對照，并經BLAST比較沒有發現同源序列，命名為NC。

2.shRNA載體的構建及鑒定：分別取2μl上述合成的DNA正義和反義鏈表達模板，加入16μl退火緩沖液，94℃水浴5min，自然冷卻至室溫，使互補的正、反向鏈模板結合形成雙鏈。將退火后形成雙鏈的寡核苷酸鏈與經BamH I和Bbs I雙酶切后的載體pGPU6/GFP/Neo用T4 DNA連接酶連接過夜。以連接產物轉化E.coliDH5α感受態細菌，在氨芐西林抗性平板上篩選陽性克隆，并對挑選的克隆經質粒小提后行酶切電泳并送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序鑒定。

3.細胞培養和轉染：293T細胞常規培養于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基中，37℃、5%CO2飽和濕度培養箱培養。將狀態良好、處于對數生長期的細胞用0.25%胰酶消化，用完全培養基懸浮成單細胞懸液，細胞計數后，1.5×106細胞/孔接種6孔板；混勻后于37℃、5%CO2培養 24 h。將 0.8μg干擾表達載體質粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA1，pGPU6/GFP/Neo-shRNA2，pGPU6/GFP/Neo-shRNA3，pGPU6/GFP/Neo-shRNA4及陰性對照載體質粒pGPU6/GFP/Neo-NC分別與0.8μg Cbl-b過表達載體pdsRed1-N1-Cbl-b混勻后轉染細胞，轉染程序按lipofectamin2000操作說明進行。轉染48 h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效率并收集細胞。實驗同時設立過表達組、過表達陰性對照組（過表達載體及陰性對照載體共轉染）、空載對照組、陰性對照組（只轉染陰性對照質粒組）。

4.實時熒光定量PCR法檢測mRNA水平變化：細胞轉染后48 h，收集細胞加入Trizol液提取細胞總RNA，并通過逆轉錄試劑盒合成cDNA。然后以各組cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，根據實時熒光定量PCR擴增曲線得到各實驗組目標和內參基因的閾值循環數（Ct值），采用△△Ct的方法進行相對定量。擴增Cbl-b基因所用上游引物為5′-GTGACTGGGGACGGCAATATCCTAC-3′；下游引物 5′-TAAA GATAAAAGCCTTCCCT GCTAC-3′。β肌動蛋白擴增上游引物為5′-CCCTGGCACCCAGCA C-3′。下游：5′-GCCGAT CCACACGGAGTAC-3′。擴增條件：95℃2min；95 ℃ 10 s；62 ℃ 40 s；40個循環后行熔解曲線分析。

5.蛋白質印跡檢測Cbl-b蛋白表達：細胞轉染48 h后，經胰酶消化，4℃離心5min，收集各組細胞，并用預冷PBS洗3次。根據細胞蛋白提取試劑盒操作步驟提取各組細胞蛋白。上樣前蛋白樣品與等量2×加樣緩沖液混勻，煮沸5min，上樣到10%SDS-PAGE中，每孔按20μl上樣。電泳分離后轉至PVDF膜，使用加樣緩沖液封閉轉印膜2 h，加入適當稀釋的Cbl-b一抗，4℃孵育過夜，次日TBST漂洗3次后加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯色。用Cbl-b與內參灰度比值表示Cbl-b蛋白的相對表達量，使用Gel-Pro Analyzer軟件分析處理。

三、結果

1.Cbl-b-shRNA序列的設計及合成：根據小鼠Cbl-b基因的編碼序列設計的4對siRNA序列，經BLAST分析小鼠基因庫中同源序列，未發現包含該序列的其他基因，說明4個靶點特異性較好。然后結合shRNA載體的結構及shRNA設計原則，由siRNA序列設計并合成了相應shRNA序列（表1）。同時設計相應的陰性對照序列。

表1 針對小鼠Cbl-b基因設計的4對shRNA寡核苷酸序列

2.重組質粒測序結果：由4對shRNA序列構建的重組質粒經測序鑒定構建成功，插入的序列和目標序列完全一致，沒有插入、缺失、突變等異常（圖1）。

3.熒光實時定量PCR檢測結果：pdsRed1-N1-Cbl-b轉染293T細胞后，細胞內Cbl-b的表達水平明顯升高（Cbl-b過表達載體轉染組，Cbl-b載體與陰性對照質粒共轉染組），而pdsRed1-N1-Cbl-b與各干擾質粒共轉染后，Cbl-b mRNA的水平則明顯下降（Cbl-b過表達載體+pGPU6/GFP/NeoshRNA1，Cbl-b 過表達載體 +pGPU6/GFP/Neo-shRNA2，Cblb過表達載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA3，Cbl-b過表達載體 +pGPU6/GFP/Neo-shRNA4），其中以shRNA-1載體對Cbl-b基因mRNA的沉默效率最高（圖2），差異有統計學意義（n=3，P＜0.05）。

4.蛋白質印跡檢測結果：結果顯示（圖3），pdsRed1-N1-Cbl-b轉染后的293T細胞高表達Cbl-b蛋白，而共轉染干擾質粒的實驗組Cbl-b蛋白的表達水平則明顯減低，其中shRNA-1載體對Cbl-b蛋白的沉默為最高，其蛋白表達水平經灰度分析下調了 88%（n=3，P<0.05）。

圖1 重組質粒的測序結果 插入的序列和目標序列完全一致，沒有插入、缺失、突變等異常

圖2 各組Cbl-b基因mRNA表達水平的檢測 C：Cbl-b過表達載體轉染組；C+N：Cbl-b載體與陰性對照質粒共轉染組；B：空白細胞組；N：陰性對照質粒轉染組；K：Cbl-b載體對應空載組；1：Cbl-b過表達載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA1；2：Cbl-b過表達載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA2；3：Cbl-b過表達載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA3；4：Cbl-b過表達載體 +pGPU6/GFP/Neo-shRNA4

圖3 蛋白印跡檢測各組Cbl-b基因蛋白水平的表達 1：Cbl-b過表達載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA-1組；2：Cbl-b過表達載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA-2組；3：Cbl-b過表達載體+pGPU6/FP/Neo-shRNA-3組；4：Cbl-b過表達載體+pGPU6/GFP/Neo-shRNA-4組；5：Cbl-b載體對應空載組；6：Cbl-b過表達載體轉染組；7：Cblb載體與陰性對照質粒共轉染組；8：陰性對照質粒轉染組；9：空白細胞組

四、討論

Cbl-b是泛素連接酶E3家族的重要成員，可使細胞內許多重要信號分子泛素化，使其失去功能或介導其通過泛素-蛋白酶體/溶酶體途徑降解。Cbl-b在免疫耐受、變態反應及細胞分化等過程中起重要作用［3-4］。Cbl-b控制著T細胞對弱抗原肽反應活化的閾值［5］，其表達的下調可降低T細胞對免疫抑制信號的反應性。當外來抗原刺激時，即使在沒有共刺激信號分子的輔助下，Cbl-b缺陷T細胞的增殖以及細胞因子分泌能力也有所增強［6-7］。另外，除了參與控制近端抗原受體信號途徑外，Cbl-b可能還介導某些特定的T細胞活化途徑，如由Vav1介導的免疫突觸的形成［8］。體外抑制試驗發現，Cbl-b-/-CD4+T細胞對Treg及TGFβ介導的免疫抑制效應均可產生一定的抵抗力［9］。對Cbl-b分子的深入研究，有助于尋求腫瘤免疫治療中的新的靶標分子。

RNA干擾技術是一項依賴RNA的轉錄后基因沉默技術，能通過雙鏈RNA（dsRNA）特異性地抑制與其序列同源的靶基因mRNA的表達［10］。它作為一種簡便、高效、特異地抑制靶基因表達的新技術而廣泛應用于基因功能分析、抗病毒和腫瘤治療的研究中。常用體外化學合成小片段siRNA，此法操作簡單快速，但其RNA干擾效應僅呈瞬時效應，難以持久。shRNA表達載體系統產生短發夾型RNA來完成RNA干擾，其DNA表達框轉錄產物可以在細胞內自發形成siRNA［11-12］。針對同一基因的不同靶點而產生不同的干擾效果，提示RNA干擾具有一定的靶點效應，同時也說明利用RNA干擾進行相關研究前，首先需要對干擾序列進行篩選。本實驗的目的基因導入采用載體法，針對小鼠Cbl-b基因設計合成4條編碼目標shRNA的DNA，并插入適用于RNAi實驗的表達質粒pGPU6/GFP/Neo，構建編碼目的shRNA的真核表達質粒。這比直接導入siRNA能產生更持久的沉默效應。

從實驗結果可以看出，我們所制備的質粒經測序鑒定，插入的序列和目標序列一致，沒有插入、缺失、突變等異常，表明成功構建了攜帶shRNA的真核表達載體，經實時熒光定量PCR和蛋白質印跡檢測，設計的shRNA都能在一定程度上沉默靶基因mRNA以及蛋白的表達，其中以shRNA1的沉默效應最強，其功能有待進一步探討。

［1］Heissmeyer V,Macián F,Im SH,et al.Calcineurin imposes T cell unresponsiveness through targeted proteolysis of signaling proteins［J］.Nat Immunol,2004,5（3）:255-265.

［2］Jeon MS,Atfield A,Venuprasad K,et al.Essential role of the E3 ubiquitin ligase Cbl-b in T cell anergy induction ［J］.Immunity,2004,21（2）:167-177.

［3］Mueller DL.E3 ubiquitin ligases as T cell anergy factors［J］.Nat Immunol,2004,5（9）:883-890.

［4］Paolino M,Penninger JM.E3 ubiquitin ligases in T-cell tolerance［J］.Eur J Immunol,2009,39（9）:2337-2344.

［5］Gronski MA,Boulter JM,Moskophidis D,et al.TCR affinity and negative regulation limit autoimmunity ［J］.Nat Med,2004,10（11）:1234-1239.

［6］Bachmaier K,Krawczyk C,Kozieradzki I,et al.Negative regulation of lymphocyte activation and autoimmunity by the molecular adaptor Cbl-b［J］.Nature,2000,403（6766）:211-216.

［7］ChiangYJ,KoleHK,BrownK,etal.Cbl-bregulatestheCD28dependence of T-cell activation［J］.Nature,2000,403（6766）:216-220.

［8］Krawczyk C,Bachmaier K,Sasaki T,et al.Cbl-b is a negative regulator of receptor clustering and raft aggregation in T cells［J］.Immunity,2000,13（4）:463-473.

［9］Wohlfert EA,Callahan MK,Clark RB.Resistance to CD4+CD25+regulatory T cells and TGF-beta in Cbl-b-/-mice［J］.J Immunol,2004,173（2）:1059-1065.

［10］Ortiz-Quintero B.RNA interference:from origins to a novel tool for gene silencing［J］.Rev Invest Clin,2009,61（5）:412-427.

［11］Liu YP,Schopman NC,Berkhout B.Dicer-independent processing ofshorthairpinRNAs［J］.NucleicAcidsRes,2013,41（6）:3723-3733.

［12］韓永智,孫建方,周武慶,等.短發卡RNA對人黑素瘤細胞BRAF 基因的沉默作用［J］.中華皮膚科雜志,2006,39（11）:625-628.

2014-05-22）

（本文編輯：吳曉初）

Construction and identification of a short hairpin RNA expression vector targeting the Cbl-b gene

Hu Bin,Ni Nana,Lyu Yalin,Chen Hao,Liu Yi,Sun Jianfang.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

s:Sun Jianfang,Email:Sunjf57@163.com;Liu Yi,Email:dr.liuyi@gmail.com

ObjectiveTo construct a eukaryotic expression plasmid vector encoding Cbl-b gene-specific short hairpin RNAs （shRNAs）,and to evaluate its interference effect,so as to lay a foundation for further study on the role of Cbl-b in the immunotherapy of malignant melanoma.MethodsAccording to the sequence of Cbl-b cDNA,4 pairs of shRNAs targeting the Cbl-b gene were designed and synthesized,and then inserted into the plasmid PGPU6/GFP/Neo to construct recombinant plasmids.After identification by DNA sequencing,the 4 shRNA expression vectors were cotransfected into 293T cells with the Cbl-b gene eukarytic expresson plasmid,respectively.The knockdown efficiency of these shRNA expression plasmids on Cbl-b expression was evaluated by real-time（RT）fluorescence-based quantitative PCR and Western blot at 48 hours aftert transfection.ResultsSequencing analysis revealed that all the 4 pairs of shRNAs were successfully inserted into the eukarytic expression vector PGPU6/GFP/Neo.As RT-PCR and Western blot showed,all the 4 shRNA-expressing vectors could downregulate Cbl-b expession,and the NO.1 shRNA-expressing vector displayed the strongest interference effect（P＜0.05）.ConclusionsA eukaryotic expression plasmid vector was successfully constructed for Cbl-b gene-specific shRNAs,and the most effective shRNA was selected in this study.

Ubiquitin-protein ligases;RNA,small interfering;Melanoma;Genes,Cbl-b

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.018

國家自然科學基金面上項目（81171513）

210042南京，中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所

孫建方，Email：sunjf57@163.com；劉毅，Email：dr.liuyi@gmail.com