阿維A聯合克拉霉素對裸鼠移植瘤生長及腫瘤血管生成的影響

趙雁 葉郁紅 吳麗賢 方芳 程波

阿維A聯合克拉霉素對裸鼠移植瘤生長及腫瘤血管生成的影響

趙雁 葉郁紅 吳麗賢 方芳 程波

目的 觀察阿維A聯合克拉霉素對人口腔表皮樣癌裸鼠移植瘤生長的影響，探討藥物對腫瘤抑制的作用機制。方法 用人口腔表皮樣癌細胞建立裸鼠皮下移植瘤模型。采用隨機雙盲設計，將31只裸鼠隨機分6組，對照組、安慰劑組、阿維A組、克拉霉素組、阿維A+安慰劑組、阿維A+克拉霉素組。對照組6只，余各組均為5只裸鼠。各組治療3周后測量移植瘤體積和重量，用RT-PCR檢測血管內皮生長因子（VEGF）和核轉錄因子κB（NF-κB）mRNA的表達。對移植瘤體進行病理學分析，采用免疫組化染色檢測各組腫瘤中VEGF、細胞增殖指數Ki-67的表達及其微血管密度（MVD）。采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料的均數比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。結果 阿維A+克拉霉素組瘤體體積、瘤體重量均低于其他5組，差異有統計學意義（均P<0.05）。實時熒光定量PCR檢測，阿維A+克拉霉素組VEGF、NF-κB mRNA的表達均低于對照組、克拉霉素組、阿維A組，差異均有統計學意義（均P<0.05）。免疫組化檢測，與對照組、克拉霉素組、阿維A組相比，阿維A+克拉霉素組VEGF表達率均下調（均P<0.01），著色淺；MVD顯著降低（均P<0.01），微血管分布較稀疏；Ki-67陽性指數均降低（均P<0.05），腫瘤細胞增殖減少。結論 阿維A聯合克拉霉素能協同抑制人口腔表皮樣癌裸鼠移植瘤的生長，并下調VEGF表達，抑制血管生成和腫瘤增殖。

異種移植模型抗腫瘤試驗；阿維A；克拉霉素；癌，鱗狀細胞；血管內皮生長因子類；NF-κB；Ki-67

我們在臨床中偶然應用阿維A聯合克拉霉素配合CO2激光治愈1例女性面部鱗狀細胞癌患者［1］。為進一步研究它們的抗腫瘤機制，我們建立了人口腔表皮樣癌裸鼠移植瘤模型，應用阿維A和克拉霉素進行干預，觀察瘤體體積、重量、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、核轉錄因子κB（NF-κB）的表達及各組移植瘤體病理變化，免疫組化檢測VEGF表達率、細胞增殖指數Ki-67、微血管密度（microvessel density，MVD）的差異。

一、材料

人口腔表皮樣癌細胞株（福建醫科大學新藥物研究所贈送），RPMI 1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Amresco公司），Trizol RNA提取試劑（美國Invitrogen公司），阿維A膠囊（重慶華邦制藥有限公司），克拉霉素（江蘇恒瑞公司），RT-PCR引物（上海鉑尚生物技術服務有限公司合成）。無特定病原體（SPF）級飼養裸鼠，雌性，4～5周齡，體重16～18 g，購于福建醫科大學動物實驗室（動物檢疫合格證號：201200056005）。鼠抗人CD34免疫組化單克隆抗體、兔抗鼠VEGF多克隆抗體為福州邁新生物技術開發有限公司產品，鼠抗人Ki-67單克隆抗體為北京中杉金橋公司產品。

二、方法

1.細胞培養：人口腔表皮樣癌KB腫瘤細胞生長于RPMI 1640培養基中，培養液含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/L鏈霉素，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱常規培養。貼壁生長細胞以0.25%胰酶消化傳代。

2.人口腔表皮樣癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分組：裸鼠飼養于恒溫［（25±2）℃］、恒濕（45%～50%）、超凈化生物層流架環境內，定期紫外線消毒，飲水經高壓蒸汽滅菌，實驗操作都在無菌環境下進行。將培養基中人口腔表皮樣癌細胞經胰蛋白酶消化后，調整至1×108/L，在裸鼠背部接種0.2ml，無菌飼養2周，瘤體生長至1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm后開始治療。按臨床實驗隨機雙盲標準，加入安慰劑，實驗員不知治療藥物。裸鼠按隨機數字表法分為6組，對照組、安慰劑組、阿維A組、克拉霉素組、阿維A+安慰劑組、阿維A+克拉霉素組。對照組6只，余各組均為5只裸鼠。將阿維A、克拉霉素及面粉分別溶解于生理氯化鈉溶液，渦旋混勻，分別以灌胃器經口將藥直接灌入各組裸鼠胃中，以患者臨床治療劑量換算為裸鼠治療劑量，克拉霉素100 mg·kg-1·d-1，阿維A 7.2 mg·kg-1·d-1，安慰劑為面粉，除對照組外，各組每天給藥1次。3周后處死裸鼠，測量瘤塊體積和重量。

3.實時定量PCR檢測瘤體中VEGF及NF-κB mRNA的表達：取20 mg新鮮瘤體，加入Trizol后勻漿，按Invitrogen Trizol說明書提取RNA，隨后反轉錄成cDNA，稀釋后進行定量PCR檢測。引物序列：VEGF 正向 5′-CATTGGAGCCTTGCCTTG-3′，反向5′-TTCGTGGGGTTTCTGGTCT-3′，產物大小 90 bp；NF-κB 正向 5′-CCGCACCTCCACTCCATCC-3′，反向 5′-ACATCAGCACCCAAGGACACC-3′，產物大小121 bp；內參引物GAPDH正向5′-CCGTCTAGAAA AACCTGCC-3′，反向 5′-GCCAAATTCGTTGTCATACC-3′，產物大小217 bp。實時定量PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s共40個循環，60～95℃以5℃為梯度采集熔解曲線。每個實驗重復3次。

4.免疫組化檢測移植瘤中VEGF、Ki-67的表達及其MVD：將人口腔表皮樣癌移植瘤塊以4%多聚甲醛固定，常規病理切片檢查，免疫組化EnVision法染色。主要步驟：①切片經脫蠟、水化；②預處理組織切片，熱修復（CD34染色前需用10 mmol/L pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液高壓加熱抗原修復）；③滴加3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育10min；④加一抗室溫孵育30min，分別加鼠抗人單克隆VEGF（1∶100）、CD34（1 ∶100）、Ki-67（1 ∶100）；⑤加 EnVision 二抗室溫孵育30min。二氨基聯苯胺（DAB）顯色，顯微鏡下觀察顯色。用已知VEGF、Ki-67陽性乳腺癌和CD34陽性扁桃體組織切片作為陽性對照。光鏡下（×200）觀察，VEGF陽性細胞為腫瘤細胞胞質內棕黃色顆粒，Ki-67陽性部位為細胞核內棕黃色，每張切片計數5個視野，觀察不少于1 000個細胞，分別計算VEGF與Ki-67陽性細胞百分比。CD34陽性為棕色血管內皮細胞，光鏡下（×200）計數10個區域，計數每個區域內血管數，取平均數作為該組瘤塊的MVD。

5.統計學方法：采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料的均數比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

三、結果

1.各組裸鼠皮下移植瘤體的體積、重量的比較：裸鼠喂藥3周后處死。各組動物至實驗結束時無死亡，均全部進入指標檢測。測量體重；剝離瘤體稱重和體積測量，結果見表1。治療后各組移植瘤體積、重量比較，差異有統計學意義（均P＜0.05）。組間兩兩比較，阿維A+克拉霉素組瘤體體積、瘤體重量均低于其他各組（均P＜0.05）；阿維A組與克拉霉素組分別與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。各組裸鼠體重總體比較差異無統計學意義。

表1 裸鼠移植瘤各組經治療后移植瘤體積、重量及裸鼠體重比較（±s）

表1 裸鼠移植瘤各組經治療后移植瘤體積、重量及裸鼠體重比較（±s）

組別 只數 瘤體體積（mm3） 瘤體重量（g） 裸鼠體重（g）對照組 6 1750.10±156.76 1.48±0.13 21.64±1.67安慰劑組 5 1745.92±192.21 1.72±0.24 23.09±1.96克拉霉素組 5 1822.34±334.31 1.64±0.47 22.81±0.83阿維A組 5 1470.92±143.65 1.40±0.09 22.18±1.32阿維A+安慰劑組 5 1621.34±195.64 1.45±0.10 22.01±0.36阿維A+克拉霉素組 5 1185.10±177.71 1.12±0.16 21.97±0.76 F值 4.66 3.19 0.52 P值 0.04 0.02 0.76

2.實時熒光定量PCR檢測瘤體中VEGF、NF-κB mRNA的表達：治療后對照組、克拉霉素組、阿維A組、阿維A+克拉霉素組瘤體中VEGF、NF-κB mRNA的表達比較差異有統計學意義（F=6.53、6.10，均P＜0.05）。組間兩兩比較，阿維A+克拉霉素組VEGF、NF-κB mRNA的表達均低于其他各組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；阿維A組與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；克拉霉素組與對照組比較，VEGF mRNA的表達差異無統計學意義（P＞0.05），而NF-κB mRNA的表達明顯高于對照組（P＜0.05）。見圖1。

3.移植瘤體的組織學及免疫組化觀察：組織切片HE染色（圖2），阿維A+克拉霉素組瘤組織排列疏松，瘤細胞分裂較少，胞質豐富，組織中可見到蛋白物質及細胞碎片。其他各組癌巢體積較大，瘤細胞形態不規則，核質較大，病理性核分裂較多。克拉霉素組見較多單核細胞。

免疫組化結果顯示（表2），對照組、克拉霉素組、阿維A組、阿維A+克拉霉素組裸鼠瘤體VEGF、MVD、Ki-67表達比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。與其他3組比較，阿維A+克拉霉素組VEGF表達率降低（均P＜0.01），著色淺；MVD顯著降低（均P＜0.01），微血管分布較稀疏；Ki-67陽性指數均低于其他3組（均P＜0.05），腫瘤細胞增殖減少。阿維A組與對照組比較，VEGF、MVD和Ki-67均降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；克拉霉素組與對照組比較，VEGF、MVD和Ki-67的差異均無統計學意義。

圖1 裸鼠移植瘤組織中血管內皮生長因子（VEGF）和核轉錄因子 κB（NF-κB）mRNA 相對表達量

表2 裸鼠移植瘤瘤體血管內皮生長因子（VEGF）、微血管密度（MVD）、Ki-67表達（%，±s）

表2 裸鼠移植瘤瘤體血管內皮生長因子（VEGF）、微血管密度（MVD）、Ki-67表達（%，±s）

組別 只數 VEGF MVD Ki-67對照組 5 78.21±2.83 6.40±1.14 82.34±2.35克拉霉素組 5 81.45±3.57 5.80±0.84 78.43±3.07阿維A組 5 69.77±2.58 4.40±0.55 64.56±2.45阿維A+克拉霉素組 5 53.64±3.04 2.00±0.71 48.72±3.46 F值 20.32 27.31 28.49 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

四、討論

研究發現，干預腫瘤組織中已有和（或）正在形成的血管，阻斷血管生成的通路，能夠有效抑制腫瘤生長和增殖，使其處于休眠狀態［2］。有研究表明，抑制移植瘤中VEGF的表達即血管生成，可抑制腫瘤的生長［3］。有研究表明，NF-κB與鱗狀細胞癌、黑素瘤、結腸癌的轉移有關［4］，還在抗細胞凋亡中起著重要作用［5］。抑制NF-κB、VEGF靶向治療的新型藥物與惡性腫瘤治療策略是目前研究熱點［3，6］。

體外實驗［7-8］表明，阿維A能抑制鱗癌細胞的增殖，促進鱗癌細胞的凋亡。溫炬等［9］的研究顯示，銀屑病患者經阿維A治療后，皮損的MVD值、VEGF蛋白的表達及血清中VEGF水平較治療前明顯減低。Mikasa等［10］應用克拉霉素治療非小細胞肺癌。Yatsunami等［11］研究表明，羅紅霉素和克拉霉素有抑制小鼠B16BL6黑素細胞瘤生長的作用。腫瘤組織中的MVD是間接測量腫瘤血管生成的指標之一，它與多種腫瘤的臨床分期、病理分級以及預后有關［12］。

人口腔表皮樣癌裸鼠移植瘤具有惡性腫瘤原位移植的特點，接近惡性實體腫瘤的組織學特征，可以更好地模擬臨床惡性腫瘤發生、發展和治療的過程。臨床中我們觀察到阿維A聯合克拉霉素對皮膚實體惡性腫瘤有抑制作用，但無法證實兩者的協同作用。我們在裸鼠體內進一步研究阿維A聯合克拉霉素藥物抗腫瘤作用機制。結果表明，阿維A聯合克拉霉素組VEGF、MVD、Ki-67表達都明顯低于對照和單獨用藥組。移植瘤瘤體體積、重量、實時熒光定量PCR檢測的VEGF、NF-κB mRNA表達結果與免疫組化顯示的血管生成、組織增殖表達結果基本一致，表明阿維A聯合克拉霉素對人口腔表皮樣癌移植瘤比單獨用藥和對照組有明顯的抑制作用，并且可以下調VEGF和NF-κB的表達，抑制血管生成。與對照組比較，阿維A組免疫組化檢測VEGF、MVD、Ki-67表達均明顯降低，但瘤體體積、重量及VEGF、NF-κB mRNA的表達差異無統計學意義，說明阿維A抗腫瘤血管生成作用先于瘤體重量、體積等指標出現。阿維A聯合克拉霉素組所有觀察指標均低于阿維A組，證實兩者聯合用藥有抗腫瘤的協同作用。

本實驗中，我們觀察到阿維A與克拉霉素的聯合應用增強了藥物抗血管增生的作用，抑制了血管因子水平和腫瘤生長。我們從臨床逆向實驗室研究，可以驗證臨床觀察到阿維A聯合克拉霉素聯合應用后，腫瘤體積縮小。但這只是實驗研究的初步探討，還需要深入的后續研究。

圖2 各組裸鼠移植瘤組織病理學觀察（HE×200） 阿維A+克拉霉素組瘤組織排列疏松，瘤細胞分裂較少，胞質豐富，組織中可見到蛋白物質及細胞碎片。其他各組腫瘤癌巢體積較大，瘤細胞形態不規則，核質較大，病理性核分裂較多。克拉霉素組見較多單核細胞

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2014-05-06）

（本文編輯：周良佳 顏艷）

Effects of acitretin combined with clarithromycin on tumor growth and angiogenesis in human oral epidermoid carcinoma xenografts in nude mice

Zhao Yan*，Ye Yuhong,Wu Lixian,Fang Fang,Cheng Bo.*First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fujian Provincial Institute of Dermatology，Fuzhou 350009，China

Cheng Bo,Email:chengbofj@gmail.com

ObjectiveTo evaluate the effects of acitretin combined with clarithromycin on tumor growth in human oral epidermoid carcinoma xenografts in nude mice,and to investigate their antitumor mechanisms.MethodsA cell line of human oral epidermoid carcinoma was subcutaneously inoculated into 31 Balb/c nude mice to establish a xenograft model of human skin tumor.Then,the nude mice were randomly classified into 6 groups according to a double blind protocol:control group（n=6）remaining untreated,placebo group（n=5）treated with wheat flour,acitretin group（n=5）treated with acitretin 7.2 mg/kg per day,clarithromycin group（n=5）treated with clarithromycin 100 mg/kg per day,acitretin+placebo group （n=5）treated with both acitretin （7.2 mg/kg per day）and wheat flour,and acitretin+clarithromycin group （n=5）treated with acitretin （7.2 mg/kg per day）and clarithromycin 100 mg/kg per day.All the drugs were intragastrically administrated once daily.After three weeks of treatment,mice were sacrificed and xenografts were removed.Then,the size and weight of xenografts were measured,and pathological analysis was conducted.Real time-PCR was performed to quantify the mRNA expressions of vascular endothelial growth factor（VEGF）and nuclear factor （NF）-κB,and immunohistochemistry was carried out to observe the expression of VEGF as well as to determine microvessel density（MVD）and Ki-67 proliferation index.By using the software SPSS 19.0,analysis of variance was performed for comparison of measurement data,and least significant difference （LSD）test for paired comparisons.ResultsBoth the size and weight of xenografts in the acitretin+clarithromycin group were significantly lower than those in the other groups （allP<0.05）.Real-time fluorescence-based PCR revealed weaker mRNA expressions of VEGF and NF-κB in the acitretin+clarithromycin group compared with the control group,clarithromycin group and acitretin group （allP<0.05）.As immunohistochemistry showed,the acitretin+clarithromycin group displayed a decrease in the expression rate （allP<0.01）and staining intensity of VEGF,MVD （allP<0.01）with a sparse distribution of microvessels,Ki-67 proliferation index（allP<0.05）and proliferative activity of tumor cells compared with the control group,clarithromycin group and acitretin group.Conclusion Acitretin combined with clarithromycin can synergistically inhibit the growth of human oral epidermoid carcinoma xenografts in nude mice,downregulate VEGF expression,and suppress angiogenesis and tumor proliferation.

Xenograft model antitumor assays;Acitretin;Clarithromycin;Carcinoma,squamous cell;Vascular endothelial growth factors;NF-kappa B;Ki-67

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.016

福建省衛生廳醫學創新課題（2011-CXB-11）

350009福州，福建醫科大學附屬第一醫院，福建省皮膚病研究所（趙雁、方芳、程波），病理研究室（葉郁紅）；福建醫科大學新藥物研究所（吳麗賢）

程波，Email：chengbofj@gmail.com