半巢式RT—Realtime PCR檢測南芥菜花葉病毒

粟智平++楊益娥++鄧叢良++李金慶++王穎++段效輝

摘要 根據(jù)南芥菜花葉病毒（ArMV）外殼蛋白（CP）基因的保守序列，設(shè)計合成了3條巢式PCR引物和1條TaqMAN熒光探針，建立了半巢式RT-Realtime PCR檢測ArMV的新方法。該方法有機地結(jié)合了巢式PCR和TaqMAN探針檢測技術(shù)。第二步半巢式-RT-Realtime PCR既是對第一步信號的進一步放大，也是對第一步PCR產(chǎn)物的確認，因此，檢測的準(zhǔn)確性、靈敏度比巢式PCR、Realtime PCR等方法高。結(jié)果表明：該方法檢測靈敏度可達0.06 fg/μL植物總RNA。

關(guān)鍵詞 南芥菜花葉病毒（ArMV）；半巢式RT-Realtime PCR；檢測

中圖分類號 S41-30 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）18-0145-03

Dectection of Arabis Mosaic Virus by Semi-Nested RT-Realtime PCR

SU Zhi-ping 1 YANG Yi-e 2 DENG Cong-liang 3 LI Jin-qing 1 WANG Ying 1 DUAN Xiao-hui 1

（1 Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai Shandong 264000； 2 Huitong County Agriculture Bureau of Hunan Province；

3 Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

Abstract Three nested primers and one TaqMAN probe were designed according to the CP gene of the Arabis mosaic virus，with which we set up a new method of semi-nested RT-Realtime PCR to detect the ArMV.The nest-PCR and the probe-detection technique were combined maneuverably in this study.The semi-nested RT-Realtime PCR in the second step could both magnify the sigal and validate the result of the first step，which could provide a more sensitive and specific detection of the ArMV.The sensitivity of the method could reach 0.06 fg/μL of total plant RNA.

Key words Arabis mosaic virus（ArMV）；Semi-Nested RT-Realtime PCR；dectection

南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）可侵染植物約174屬215種，主要危害黃瓜、馬鈴薯、胡蘿卜、櫻桃、葡萄、草莓、大豆、菜豆等經(jīng)濟作物。其地理分布極廣，在五大洲30余個國家有發(fā)生，屬于世界性病害[1]。在我國未見該病毒危害的報道，是我國對外重要的檢疫性植物病毒，是我國進境種子苗木必檢項目，因此開發(fā)出快速、靈敏檢測ArMV的技術(shù)的意義重大[2-3]。

目前，實時熒光PCR、電鏡技術(shù)、RT-PCR、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等是我國南芥菜花葉病毒的主要檢測技術(shù)[4-9]，但這些技術(shù)均有弊端。該文有機結(jié)合巢式PCR和實時熒光PCR技術(shù)，建立一套“半巢式RT-Realtime PCR”檢測ArMV的分子技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯黑環(huán)斑病毒（PBRSV）、馬鈴薯Y病毒脈壞死株系（PVYN）核酸、南芥菜花葉病毒（ArMV）、馬鈴薯X病毒（PVX），由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動植物檢疫研究所提供。核酸蛋白分析儀為BioPhotometer（德國eppendorf公司）；實時熒光PCR試劑盒，購自美國Invitrogen公司；實時熒光PCR基因擴增儀為ABI PARISM 7000（美國ABI公司）；納米磁珠法植物總RNA提取試劑盒由北京出入境檢驗檢疫局提供；……