半巢式RT—Realtime PCR檢測番茄叢矮病毒

粟智平++楊益娥++趙偉鐸++李金慶++鄧叢良++尹偉力

摘要 番茄叢矮病毒（ToBSV）是我國進境植物檢疫對象，也是進境種子苗木等必檢項目。該病毒能侵染番茄、曼陀羅、葡萄、豇豆等20余科120余種植物。該研究根據ToBSV全基因組中p33蛋白基因，設計引物和TaqMan探針，建立了半巢式實時PCR檢測ToBSV的新方法。該研究巧妙地融合了巢式PCR和TaqMan探針技術，第二步半巢式-RT-Realtime PCR既進一步放大了第一步檢測信號，也是對第一步PCR產物的確認，與單一的巢式PCR或Realtime PCR等方法相比其檢測的準確性、靈敏度更高。該方法檢測靈敏度可達50 fg/μL植物總RNA。

關鍵詞 番茄叢矮病毒（ToBSV）；半巢式RT-Realtime PCR；檢測

中圖分類號 S41-30 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）18-0148-03

Dectection of Tomato Bushy Stunt Virus by Semi-nested RT-Realtime PCR

SU Zhi-ping 1 YANG Yi-e 2 ZHAO Wei-duo 1 LI Jin-qing 1 DENG Cong-liang 3 YIN Wei-li 1

（1 Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai Shandong 264000； 2 Huitong County Agriculture Bureau of Hunan Province；

3 Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

Abstract Tomato bushy stunt virus（ToBSV）is a plant quarantine object in China，and it is a required inspection item for the imported grapes and so on.This virus can infect 120 kind of 20 families of plants，such as tomato，Datura stramonium L.，grape and cowpea.Three nested primers and one TaqMan probe were designed according to the p33 protein gene of the ToBSV，with which we set up a new method of semi-nested RT-Realtime PCR to detect the ToBSV.The nest-PCR and the probe-detection technique were combined maneuverably in this study.The semi-nested RT-Realtime PCR in the second step can both magnify the sigal and validate the result of the first step，which can provide a more sensitive and specific detection of the ToBSV.The sensitivity of the method can reach 50 fg/μL of total plant RNA.

Key words tomato bushy stunt virus（ToBSV）；semi-Nested RT-Realtime PCR；dectection

番茄叢矮病毒（ToBSV）屬番茄叢矮病毒科番茄叢矮病毒屬病毒[1]。該病是我國對外制種的檢疫對象，也是進境葡萄等種子苗木必須施檢的項目。近年來，為了促進我國葡萄業及葡萄酒產業的壯大，我國從美國、法國、意大利等進口大量葡萄苗。這些葡萄苗大都來自番茄叢矮病毒的疫區，極有可能攜帶有該病毒，因此，開發出快速、靈敏檢測ToBSV的技術意義重大。

ToBSV病毒粒體為球狀，直徑30 nm，正20面多角體，分散在細胞質和液泡內。其體外存活期為幾周，致死溫度為80～90 ℃條件下10 min。該病毒能侵染番茄、曼陀羅、葡萄、豇豆等20余科120余種植物[2]。苗期受害后，初有環狀壞死斑出現，葉片褪綠且掉落。如果苗期施用氮肥過多，在莖組織中發展很快，莖部變軟，引起猝倒。系統癥狀表現為頂部壞死或幼葉卷曲，有叢生或側芽增生。病株底部葉片褪綠和變紫，番茄成熟果實上除有褪綠斑之外，還可產生平行斑或環斑。……