膠體金法與ELISA法檢測(cè)抗CCP抗體用于診斷RA的比較研究

劉忠華++許松

[摘要] 目的 比較兩種檢測(cè)抗CCP抗體方法的優(yōu)劣。 方法 用膠體金法與ELISA法對(duì)患者血清進(jìn)行抗CCP抗體檢測(cè)，兩種方法結(jié)果不符的以臨床明確診斷確認(rèn)。結(jié)果 膠體金法靈敏度85%，特異性為97.5%，假陽(yáng)性率2.5%，假陰性率為15%；同ELISA法比較得出陽(yáng)性符合率為98.8%，陰性符合率為98.4%。結(jié)論 兩種檢測(cè)方法的靈敏度和特異性無(wú)差異，均較高，

[關(guān)鍵詞] 膠體金；ELISA；抗CCP抗體；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

[中圖分類號(hào)] R7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2015）10（a）-0025-03

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（ rheumatoid arthritis， RA） 是常見(jiàn)的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要表現(xiàn)。目前抗環(huán)瓜氨酸肽（anti- cyclic citrullinated peptide， 抗CCP）抗體的檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunoabsorbent assay ， ELISA） [1]，因其檢測(cè)試劑對(duì)環(huán)境及保存條件的限制，在基層醫(yī)院的檢驗(yàn)科和門診中較難實(shí)現(xiàn)該項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。膠體金免疫層析法（gold-immunochromatography assay，GICA）因?qū)υ噭┍４鏃l件與實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求不高，而且，試劑包裝簡(jiǎn)易，可以單獨(dú)對(duì)一份標(biāo)本進(jìn)行試驗(yàn)，其操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果直觀，穩(wěn)定性好等，應(yīng)用于抗CCP抗體檢測(cè)，可快速篩選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，使類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的早期診斷變成現(xiàn)實(shí)；滿足基層醫(yī)院、即時(shí)檢測(cè)、床邊檢測(cè)的需求，將擁有巨大的市場(chǎng)潛力和效益[2]。該文以2013年6月—2014年7月收集的200例RA患者為研究對(duì)象，對(duì)兩種診斷產(chǎn)品的臨床檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)估研究，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年6月—2014年7月來(lái)自雞西市礦業(yè)集團(tuán)總醫(yī)院確診為200例RA患者，所有患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1987年修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；同時(shí)選擇來(lái)該院進(jìn)行健康體檢的健康人員100例和非RA患者100例作為對(duì)照組；兩組人員基本情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。血清標(biāo)本抽取三組人員晨起空腹靜脈血3～5 ml，離心后血清標(biāo)本儲(chǔ)存預(yù) -70℃冰箱中待測(cè)。

1.2 試劑來(lái)源

抗CCP抗體檢測(cè)膠體金法試劑盒由上海科新生物技術(shù)股份有限公司提供；抗CCP抗體（ELISA法）試劑盒為歐洲診斷試劑公司生產(chǎn)；儀器：安圖96孔酶標(biāo)儀，25℃恒溫箱，科華洗板機(jī)。

1.3 檢測(cè)方法

分別采用膠體金免疫層析法和間接ELISA法來(lái)檢測(cè)患者血標(biāo)本中是否含有抗CCP抗體。操作按照各自試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品均作復(fù)孔且與標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)。質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果符合質(zhì)控要求。抗CCP抗體檢測(cè)試劑盒（膠體金法）采用高度特異性的抗原抗體反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)，測(cè)試時(shí)，血清標(biāo)本滴入加樣處，血清標(biāo)本中的IgG與預(yù)包被在聚酯膜上的膠體金標(biāo)記的二抗結(jié)合，結(jié)合物隨之在毛細(xì)效應(yīng)下橫向?qū)游觥．?dāng)血清中含有特異性抗CCP抗體時(shí)，泳動(dòng)到T線時(shí)被預(yù)先包被在硝酸纖維素膜上的抗原捕獲，出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，血清中若不含待測(cè)抗體時(shí)，在T線處繼續(xù)橫向?qū)游鲋罜線，C線為預(yù)先包被非特異性抗原，結(jié)合物在C線處被捕獲，此反應(yīng)為非抗原特異性的反應(yīng)，作為對(duì)照條帶，因此無(wú)論血清是否含有特異性的抗CCP抗體均在C線處形成陽(yáng)性條帶。抗CCP抗體膠體金法檢測(cè)結(jié)果參考范圍為陰性，ELISA法：< 25RU/mL。對(duì)于試驗(yàn)研究中測(cè)定結(jié)果明顯不符的樣本，將比對(duì)方法或其它方法再次重復(fù)進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，同時(shí)由臨床試驗(yàn)方根據(jù)患者的具體相關(guān)臨床癥狀和其它用以診斷該疾病的特異性指標(biāo)報(bào)告加以分析，提供不符樣本的患者臨床相關(guān)資料以便對(duì)臨床研究結(jié)果進(jìn)一步分析，并作記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

該研究所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理分析，應(yīng)用配對(duì)四格表卡方χ2檢驗(yàn)，使用Kaapa來(lái)檢驗(yàn)兩種檢驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果的一致性，P<0.05表示比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 膠體金法檢測(cè)抗環(huán)瓜氨酸抗體的診斷靈敏度、特異性分析

通過(guò)對(duì)該研究三組人員采用膠體金法檢測(cè)抗環(huán)瓜氨酸抗體診斷的靈敏度及特異性分析得知，200例RA患者診斷的靈敏度為85%，假陰性率為15%；100例健康獻(xiàn)血者診斷的特異度為98%，假陽(yáng)性率為2%；100例非RA患者診斷診斷的特異性為97.0%，假陽(yáng)性率為3%，健康獻(xiàn)血者+非RA患者診斷的特異度為97.5%，假陽(yáng)性率為2.5%，見(jiàn)表1。

表1 膠體金法檢測(cè)抗CCP抗體用于診斷RA的特異性

2.2 膠體金法與ELISA法檢測(cè)結(jié)果比較分析

通過(guò)對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果匯總統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性符合率：169/171×100%=98.8%；陰性符合率：223/229×100%=98.4%；總符合率：（169+223）/200=98.0%；試劑盒一致性評(píng)價(jià)：由計(jì)算公式：Kappa=[N（A+D）-（γ1C1+γ2 C2）]/[N2-（γ1C1+γ2C2）]，其中γ1=A+B，C1=A+C， γ2=D+C，C2=B+D，N=A+B+C+D得出：Kappa=0.959262 > 0.75。P值的計(jì)算公式是P=2[1-Φ（z0）]兩者總符合率可以達(dá)到98.0%，見(jiàn)表2。

表2 兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于自身免疫性疾病，病因尚未明了，以慢性、對(duì)稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，是一種慢性全身性炎癥性疾病。類風(fēng)濕屬于致殘性疾病，關(guān)節(jié)損害是類風(fēng)濕患者最主要的病變，患病2年即可出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)破壞，如果不能診治可出現(xiàn)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)畸形，有些病人也會(huì)出現(xiàn)血管損害。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）在我國(guó)發(fā)病率約為0.3%，女性患者居多。RA的早期診斷，一直是各國(guó)醫(yī)學(xué)專家關(guān)注的問(wèn)題[4]。現(xiàn)行的美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依靠臨床表現(xiàn)、X線以及類風(fēng)濕因子（RF）檢測(cè)。當(dāng)患者達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，患者已出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)破壞，而且，類風(fēng)濕因子缺乏特異性，不利于早期診斷、早期干預(yù)治療[5]。類風(fēng)濕的早期診斷可依靠環(huán)瓜氨酸的檢測(cè)。Nicola等[6]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)瓜氨酸抗體與人的性別、年齡沒(méi)有相關(guān)性，但與早期類風(fēng)濕密切相關(guān)。Schellekens[7]等研究了數(shù)百例有早期關(guān)節(jié)癥狀患者，隨訪一年后在486人中發(fā)現(xiàn)149人（31%）為早期RA，檢測(cè)抗CCP抗體特異性達(dá)96%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為84%。小關(guān)節(jié)侵蝕性病變有時(shí)會(huì)出現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕的早期。抗環(huán)瓜氨酸抗體與類風(fēng)濕的臨床癥狀及預(yù)后相關(guān)。Schellekens研究發(fā)現(xiàn)抗環(huán)瓜氨酸抗體陽(yáng)性是侵蝕性關(guān)節(jié)損害的一個(gè)重要標(biāo)志及危險(xiǎn)因素，并指出檢測(cè)抗CCP抗體與聯(lián)合檢測(cè)抗CCP抗體和RF相比較，對(duì)預(yù)測(cè)2年后侵蝕性關(guān)節(jié)損害無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Vallbracht等[8]人的研究顯示，RA病人在應(yīng)用DMARDs和糖皮質(zhì)激素沖擊治療期間，抗CCP抗體的水平明顯下降，提示抗CCP抗體可作為臨床判斷疾病活動(dòng)的指標(biāo)，并指導(dǎo)治療。目前市場(chǎng)上商品化抗CCP抗體檢測(cè)試劑盒也主要為ELISA試劑盒。ELISA法操作程序煩瑣，整個(gè)過(guò)程需三小時(shí)左右，亦需要專業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，并需酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，這在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室和小型門診中較難實(shí)現(xiàn)，同時(shí)基于ELISA法易受溫度和孵育時(shí)間等環(huán)境條件因素的影響，對(duì)試驗(yàn)帶來(lái)諸多不便[9]。膠體金免疫層析法（GICA）是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，以條狀纖維層析材料為固相，通過(guò)毛細(xì)效應(yīng)使樣本溶液在層析條上層析，使樣本中的待測(cè)物與金標(biāo)墊上膠體金標(biāo)記物發(fā)生免疫反應(yīng)，并與條狀纖維層析材料上的抗原（或抗體）發(fā)生免疫反應(yīng)而被截留，進(jìn)而形成肉眼可見(jiàn)的紅色條帶，得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。與其他檢測(cè)方法相比，膠體金免疫層析法方法（GICA）有以下優(yōu)點(diǎn)：①整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在5～10 min就能完成，結(jié)果判斷簡(jiǎn)單方便；②操作人員無(wú)需專業(yè)培訓(xùn)，操作簡(jiǎn)便，能在門診室、家庭用戶及基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用；③無(wú)需低溫保存，儲(chǔ)運(yùn)方便等；④其檢測(cè)性能如穩(wěn)定性好，能保存24個(gè)月；靈敏度與市售定性ELISA試劑盒相當(dāng)，能快速篩選陽(yáng)性樣本，使得膠體金層析試劑條備受歡迎。

通常產(chǎn)生膠體金方法漏檢原因考慮有以下幾種：原因及方法學(xué)差異，如層析過(guò)快，抗原與抗體未來(lái)得及結(jié)合即已越過(guò)檢測(cè)線；試紙條本身的質(zhì)量問(wèn)題；試劑本身的靈敏度較ELISA低；溫度影響，溫度過(guò)低，反應(yīng)速度降低，在5 min內(nèi)弱陽(yáng)性不能完全顯色；加樣量不足或過(guò)多；工作人員未按時(shí)間要求報(bào)結(jié)果等，而ELISA法靈敏度高，漏檢度低，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜。人血清中含有內(nèi)源性物質(zhì)（非特異性干擾物質(zhì)），影響ELISA的測(cè)定結(jié)果，并且血清中抗體與異質(zhì)抗原間的交叉反應(yīng)也能在ELISA中發(fā)生多種非特異性吸附作用，導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)。

該產(chǎn)品將環(huán)瓜氨酸肽引入試紙條中，能快速篩選出抗環(huán)瓜氨酸肽抗體陽(yáng)性樣本，對(duì)快速輔助診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎起到積極作用，實(shí)現(xiàn)基層實(shí)驗(yàn)室、即時(shí)檢測(cè)、床邊檢測(cè)的需求，同時(shí)利用ELISA法能夠定量檢測(cè)抗體濃度的優(yōu)勢(shì)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的患者作者建議用ELISA法定期監(jiān)測(cè)抗CCP抗體濃度變化以監(jiān)控療效指導(dǎo)醫(yī)生制定個(gè)性化治療方案和判斷預(yù)后[6]。

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（收稿日期：2015-07-07）