雙藤痹痛凝膠對CIA大鼠外周血調節性T細胞的作用研究

嚴國鴻　江川　潘旭東

【摘 要】 目的：分析雙藤痹痛凝膠對膠原免疫性關節炎大鼠外周CD+4CD+25FoxP3+Treg 細胞的調節作用。方法：Wistar大鼠50只，隨機分成5組，分別為正常組、模型組、雙藤痹痛凝膠高劑量組、中劑量組、低劑量組，膠原蛋白誘導大鼠關節炎，并采用流式細胞術檢測大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg及酶聯免疫吸附試驗檢測血清中IL-6表達水平。結果：與模型組比較，雙藤痹痛凝膠高、低劑量組大鼠外周血CD+4CD+25 T細胞及CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞水平顯著升高，且高、中劑量組血清IL-6水平顯著下降。結論：雙藤痹痛凝膠治療類風濕性關節炎可能通過上調外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞表達水平，降低血清IL-6水平，從而恢復免疫耐受作用。

【關鍵詞】 雙藤痹痛凝膠劑；類風濕性關節炎；調節性T細胞

【中圖分類號】R2855 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）23-0033-03

類風濕性關節炎（Rheumatoid arthritis，RA），是一種慢性全身性自身免疫性疾病，屬于中醫學“痹證”范疇，臨床常出現關節疼痛，腫脹，僵直，變形等癥狀，病情反復，嚴重影響患者的生活質量[1]。雙藤痹痛凝膠為我院院內制劑雙藤痹痛酊（批準文號： 閩藥制 Z20110008） 的基礎上研制而成的新型制劑，凝膠劑是一種以水溶性高分子化合物或親水性物質為基質，與中藥或中藥提取物混合后，涂布于布上制成的外用貼劑，具有透氣性好、載藥量大、耐汗性強，可反復黏貼，不污染衣物，藥物無致敏、無刺激性等副作用。前期臨床及動物實驗證實其具有抑制 CIA 模型大鼠足趾腫脹和關節組織病理學改變，降低其關節炎指數的作用[2]。近年的研究發現調節性T細胞的功能與數量對RA等自身免疫系統疾病的發生、發展具有重要的影響，特別是對CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞的影響，它可能成為治療類風濕性關節炎的新策略和途徑，因此，本文旨在探討雙藤痹痛凝膠是否通過調節CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞，而發揮抗RA的作用。

1 材料與儀器

11 動物 Wistar大鼠50只，雌雄各半，SPF級，體重（220±20） g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（滬）2007-0005，均由福建中醫藥大學動物實驗中心提供，動物適應性喂養1 周后開始試驗。

12 藥物與試劑 藥物 雙藤痹痛凝膠，由福建中醫藥大學藥學院提供，每片（8cm×12cm） 含雷公藤甲素24659μg，含青藤堿15589mg；空白凝膠膏劑，由福建中醫藥大學藥學院提供。試劑弗氏完全佐劑（chondrex公司，批號：7002），Ⅱ型膠原（chondrex公司，批號：2002-2）；APC-抗CD4 mAb（批號：551980）、PE-FoxP3 mAb（批號：560046）、IL-6酶聯免疫吸附試驗試劑盒（批號：F1567）均購于Bioscience公司，FITC-抗CD25 mAb（批號：553071）購于Biolegend公司，紅細胞裂解液購自美國BD公司。

13 儀器 CS-1EAS型電子天平（北京市菲姆斯科技開發公司，精度01g）；TGL-16G臺式離心機（上海儀分科學儀器有限公司）；InfiniteM200 Pro多功能酶標儀（TECAN）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）。

2 方法

21 大鼠CIA模型的建立[3-4] 取50只Wistar大鼠，隨機分成五組，每組10只，用刮毛刀刮去大鼠背部毛，以供貼藥。將弗氏完全佐劑（FAC）與2mg/mL的Ⅱ型膠原乳液等體積混合，制成1mg/ml的膠原乳劑，除正常組外，按每只大鼠02mL乳劑（含CⅡ02mg）于尾根部皮下注射造模。7d后強化1次，除正常組外，按每只大鼠01mL乳劑（含CⅡ01mg）于尾根部皮內注射造模。

22 實驗分組及給藥 除正常組外，其余各組（模型組、雙藤痹痛凝膠膏劑高、中、低劑量組）動物初次免疫后次日起開始給藥，將藥物貼于大鼠背部后，并用醫用膠布固定；每日給藥1次，連續28d。其中模型組為空白凝膠膏劑，大小為2cm×3cm；高、中、低劑量給藥組分別給于大小為1cm×3cm、2cm×3cm、3cm×3cm的雙藤痹痛凝膠膏劑。

23 流式細胞術檢測外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg 摘眼球取血，肝素抗凝收集；取血100μL，加入含有05μLCD4-FITC和25μL CD25-APC單克隆抗體的離心管中，室溫避光孵育30min；加入1mL紅細胞溶解液混勻，以1500r/min離心5min，棄其上清液；加入1mL透化緩沖液（1×），以1500r/min離心5min，以試管底部不見紅色為度；棄其上清液，加固定/透化工作液500μL震勻，4℃下避光孵育12h（或過夜）。加流式染色緩沖液以1500r/min離心5min，清洗，于上述細胞懸液，加入含有1μL FoxP3-PE單克隆抗體（設IgG2α為同型對照）震勻，室溫避光孵育30min，加流式染色緩沖液清洗，加01moL/L PBS調定至300μL，上流式細胞儀檢測。

24 酶聯免疫法檢測血清IL-6表達水平 眼眶采血，1500rpm/min離心15min制備血清，待測上清液、標準品、檢測抗體使用量均為100μL，參照試劑盒的說明書檢測血清中IL-6的含量。

25 統計學分析 實驗中的檢測結果均以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P<005表示差異具有統計學意義。

3 結果

31 外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞水平 采用三色熒光法標記進行流式細胞術檢測發現，與正常組比較，模型組大鼠外周血CD+4CD+25T細胞水平顯著下降，CD+4CD+25T細胞中FoxP3+T表達明顯下降（P<005或P<001），CD+4CD+25FoxP3-T和CD+4CD+25FoxP3+T表達水平明顯明顯升高（P<005或P<001）；與模型組比較，雙藤痹痛凝膠高、低劑量組大鼠外周CD+4CD+25T細胞水平顯著升高，同時CD+4CD+25T細胞中FoxP3+T表達水平明顯升高，CD+4CD+25FoxP3+T表達水平顯著下降（P<005或P<001）。而雙藤痹痛凝膠中劑量組除了CD+4T細胞及CD+4CD+25FoxP3+T顯著下降外（P<001），其余無明顯變化。

32 大鼠血清中IL-6表達水平 與正常組比較，模型組的IL-6水平顯著升高（P<001），雙藤痹痛凝膠高、中劑量組與模型組比較，均能顯著降低IL-6表達水平（P<005或P<001），而低劑量組無明顯變化。

4 討論

已有文獻研究表明，CD+4CD+25T細胞的數量減少或者功能的異常可能是由于其參與了類風濕性關節炎等自身免疫系統疾病的發生[5]，而FoxP3（Forkhead boxP3，FoxP3）則是目前公認的CD+4CD+25T細胞特異性標志，其基因表達調控著免疫T細胞的產生和成熟，一旦CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞表達下降，可能直接影響機體免疫耐受，最終導致自身免疫性疾病的發生[6]。因此，研究CD+4CD+25T細胞及其特異性標志物FoxP3，在類風濕性關節炎的治療中具有重要的意義。

本實驗結果表明，雙藤痹痛凝膠在一定劑量下可降低CD+4T細胞水平，同時升高CD+4CD+25T細胞水平和CD+4CD+25T細胞中FoxP3+表達水平，降低IL-6水平。這可能就是前期研究發現，雙藤痹痛凝膠具有抑制CIA模型大鼠足趾腫脹和關節組織病理學改變，降低其關節炎指數作用機制之一。

參考文獻

[1]胡蔭奇.風濕性疾病診斷治療指南[M].1版.北京：中國協和醫科大學出版社，2006：84.

[2]嚴國鴻，黃燕，李煌，等.雙藤痹痛凝膠膏劑對膠原誘導性關節炎模型大鼠的作用[J].中藥藥理與臨床，2014，01：119-121.

[3]郭應強，邱桐，曾昭洋，等.敦煌消痹定痛酊對膠原誘導性大鼠關節炎病理形態學的影響[J].中醫兒科雜志，2007，3（1）：14-16.

[4]趙海梅，劉端勇，程紹民，等.Ⅱ型膠原蛋白對CIA大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+ T細胞的影響[J].細胞與分子免疫學雜志，2011，27（3）：290-291.

[5]MorganME， Sutmuller RPM， Witteveen HJ， et al. CD25+ cell depletion hastens the onset of severe disease in collagen-induced arthritis[J]. Arthritis Rheum， 2003， 48 （5）：1452-1460.

[6]Hori S， Nomura T， Sakaguchi S，et al. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3 [J]. Science， 2003， 299（5609）：1057-1061.

（編輯：梁志慶）