靶向抑制EGFR核轉位對鼻咽癌細胞輻射耐受相關分子DNA-PK活化的作用*

馬士淇，李 璐，劉惠芬，郎錦義，黃建鳴

(四川省腫瘤醫院·研究所，成都 610041)

鼻咽癌是我國南方地區的一種常見惡性腫瘤。目前主要治療方法有放療、手術、化療等，其中放療是首選治療手段。但患者放療后5年生存率僅為40%～50%，因而針對于鼻咽癌放射敏感性的研究引起臨床的重視。人類表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因 cerbB-1(HER-1)表達產生的一種酪氨酸激酶受體，研究表明在鼻咽癌細胞中EGFR存在大量表達，并和鼻咽癌的發生和發展有著密切關系［1］。傳統的受體學說認為，EGFR是細胞膜受體，然而近年來在皮膚癌及肺癌等細胞中發現電離輻射、熱休克、H2O2等應激條件能夠激活EGFR并通過磷酸化其核定位信號序列(nuclear localization signal，NLS)上Thr654與輸入素α和β相互作用而進入細胞核，在核內發揮轉錄調節和信號轉導功能。在這些新的功能中，核EGFR促進應激情況下如電離輻射誘導的DNA雙鏈斷裂(double strands breaks，DSBs)的修復尤其重要。在高等真核生物中，非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)在修復放療介導的DNA損傷中扮演關鍵角色。NHEJ依賴于DNA依賴性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)。研究發現DNA-PK Thr2609的磷酸化對其在NHEJ中發揮作用至關重要，核EGFR可以通過與DNA-PK形成復合物影響其在細胞中的分布并作為一種蛋白激酶磷酸化DNA-PK Thr2609位殘基，激活DNA-PK在NHEJ中發揮作用［2］。而這種作用機制在鼻咽癌治療耐受研究中鮮有報道。基于EGFR與鼻咽癌發生發展的密切關系，本研究考察了輻射對鼻咽癌細胞EGFR核轉位的影響，并初步探討EGFR核轉位抑制肽對鼻咽癌細胞輻射耐受相關分子DNA-PK表達的作用及其潛在的分子關聯機制。

1 材料與方法

1．1 細胞培養

人鼻咽癌CNE-1細胞株購自上海細胞庫，用含10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養液，在37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養，每2～3天傳代1次。

1．2 合成抑制肽

設計并合成與EGFR上的核定位序列(EGFRNLS)的序列相似性磷酸化多肽［Ac-RKRT(PO3H2)LRRLK］作為競爭抑制EGFR核轉位的干擾藥物，同時設計對照多肽(KKALRRQEAVNAL)，純度 ＞98%，上海楚肽生物科技有限公司。

1．3 輻射處理

取指數生長期的細胞在pT654抑制肽及對照肽(5μM)作用16h后，采用60Co γ射線照射，輻射4Gy后，將細胞置于CO2培養箱中繼續培養，在不同時間點收集細胞，提取蛋白。細胞質蛋白和核蛋白的提取采用細胞核和胞質蛋白提取試劑盒(上海生工BSP001)。

1．4 Western blot檢測

考馬斯亮藍染液測定蛋白濃度，上樣，根據蛋白分子量進行不同濃度SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質轉移通過半干轉印到固相支持體 PVDF膜上，用5%脫脂奶粉的TBST 37℃封閉1 h，分別孵育一抗:兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶20 000)(Epitmics)、兔抗人 Lamin B1單克隆抗體(1∶20 000)(Epitmics)、鼠抗人EGFR單克隆抗體(1∶5 000)(BD Biosciences)，兔抗人pEGFRThr654單克隆抗體(1∶100)(Millipore)、小鼠抗人DNA-PKcs單克隆抗體(1∶2 500)(Epitmics)、小鼠抗人pDNA-PKcsThr2609單克隆抗體(1 ∶1 000)(Abcam)，4℃ 過夜;TBST漂洗10min，3次，孵育二抗辣根酶標記山羊抗兔/鼠IgG(H+L)(中杉金橋)，37℃孵育l h;TBST漂洗10 min，3次;eECL高靈敏度化學發光檢測試劑盒曝光顯影(北京康為世紀);曝光后底片上蛋白條帶計算吸光度，分析蛋白的相對表達量。

1．5 相關性分析

應用 SPSS 19．0軟件對 pEGFRThr654和 pDNAPKThr2609的蛋白表達值進行相關性分析(Spearman)，計算線性擬合的相關系數R2值。

1.6 統計學分析

應用SPSS 19．0軟件統計學分析，實驗數據以均數±標準差表示(±s)，兩組均數的比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 放射后鼻咽癌細胞質中EGFR相關蛋白的表達

Western blot結果顯示CNE-1細胞在4Gy照射后0～40min內，細胞質中EGFR及pEGFRThr654表達呈時間依賴性增加，其中照射后40min時，CNE-1細胞質中pEGFRThr654表達量較0 min時升高，差異有統計學意義(P ＜0．05，圖1B)。

2．2 放射后鼻咽癌細胞核中EGFR及DNA-PK相關蛋白的表達

Western blot結果顯示CNE-1細胞在4Gy照射后0～40min內，細胞核中EGFR和pEGFRThr654表達以及DNA損傷修復相關蛋白pDNA-PKThr2609表達均呈時間依賴性增加，各時間點蛋白表達量與相應0min時比較，差異具有統計學意義(P＜0．05，圖2B)。在各組核蛋白樣本中，未檢測到胞質蛋白內參GAPDH表達，證實核蛋白提取過程中無胞質蛋白污染(結果未顯示)。

2．3 核轉位抑制肽對CNE-1細胞核中EGFR及DNA-PK相關蛋白的表達的影響

Western blot結果顯示CNE-1細胞經過EGFR核轉位抑制肽預處理后，核內EGFR及pEGFRThr654表達量在照射后10 min時呈現少量增加，然后隨時間延長逐漸降低，其中照射后20 min和40 min時，細胞核中EGFR和pEGFRThr654表達量較0 min時降低，差異具有統計學意義(P＜0．05，圖3B);而經過相同濃度及時間預處理的對照肽組，細胞核中EGFR及pEGFRThr654蛋白表達量隨放射后時間延長而逐漸升高。各組pDNA-PKThr2609表達呈現出與pEGFRThr654表達相同的趨勢(圖3B)。

圖1 放射后不同時間點CNE-1細胞質中EGFR相關蛋白表達情況

圖2 放射后不同時間點CNE-1細胞質中EGFR及DNA-PK相關蛋白表達情況

圖3 多肽處理放射后不同時間CNE-1細胞核中EGFR及DNA-PK相關蛋白表達情況

2．4 pEGFRThr654和 pDNA-PKThr2609的蛋白表達值相關性分析

CNE-1細胞核中pEGFRThr654表達量隨放射后時間延長逐漸增加，DNA損傷修復相關蛋白pDNAPKThr2609表達量隨放射后時間延長逐漸增加，且與pEGFRThr654表達量呈正相關(R2=0．935，圖 4A);CNE-1細胞經過EGFR核轉位抑制肽預處理后，核內pEGFRThr654表達量隨放射后時間延長而逐漸降低，同時核內pDNA-PKThr2609的表達也相應降低(R2=0．962，圖4B)。

圖4 pEGFRThr654和pDNA-PKThr2609的蛋白表達值相關性分析結果

3 討論

EGFR在許多人類惡性腫瘤中存在過表達或突變，參與腫瘤發生和惡性轉變過程。研究報道EGFR在鼻咽癌組織中高表達，是評估鼻咽癌進展和判斷預后的重要指標［3］。傳統的受體學說認為，EGFR為細胞膜受體，作為第一信使，不能進入細胞核，但近年來的研究對該觀點發出挑戰，目前已在許多腫瘤組織(如乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、頭頸鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌等)細胞核內發現高水平的EGFR 表達［4-8］。

研究報道鼻咽癌細胞中EB病毒編碼的潛伏膜蛋白1可以通過配體非依賴型方式調控EGFR核轉位，在細胞核中EGFR與STAT3相互作用，調節一系列與腫瘤侵襲性生物學行為相關的癌基因的表達，促進癌細胞增殖［9］。由此可知，核EGFR參與鼻咽癌的發生與發展。鼻咽癌目前以放射治療作為主要治療策略，研究發現放療可介導EGFR胞內近膜端核定位信號序列(NLS)上Thr654的磷酸化，通過核質轉運途徑進入細胞核，該位點在EGFR家族成員中具有高度保守性，將其刪除能夠增加放化療敏感性［2］。Dittmann 等［10］以肺癌細胞為模型發現放射誘導EGFR進入細胞核，與DNA雙鏈斷裂非同源末端連接修復(NHEJ)途徑的關鍵蛋白DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)相互作用并作為一種蛋白激酶磷酸化DNA-PK Thr2609位殘基［11］，使細胞具有促進DNA損傷修復的功能，在放療抵抗中發揮作用。而DNA損傷修復應答途徑的激活同樣是鼻咽癌輻射抵抗的原因之一［12］。基于目前關于EGFR在鼻咽癌細胞受輻射后在細胞質與細胞核中的活化分布細節，以及EGFR轉運入核后與腫瘤輻射耐受相關分子的表達情況尚未有報道。本研究檢測了輻射后EGFR在鼻咽癌細胞中的分布變化以及其與細胞輻射抵抗間的關系。

本研究選取鼻咽癌細胞中EB病毒陰性的CNE-1細胞作為研究對象，通過檢測輻射后不同時間點細胞質與細胞核相關蛋白的表達情況，發現鼻咽癌CNE-1細胞中EGFR呈高表達狀態，輻射處理后早期即可在細胞質及細胞核中檢測到EGFR及pEGFRThr654的表達，且 EGFR及 pEGFRThr654的表達均隨處理時間延長而呈增加趨勢，類似的現象已在肺癌及乳腺癌等相關文獻中報道過［13-14］，因而我們初步推測EGFR核轉位可能是EGFR過表達的腫瘤細胞經輻射后的普遍應激反應，為早期事件，在細胞核中通過激活不同靶點而為腫瘤細胞輻射耐受提供可能。同時，我們發現在細胞在無輻射處理情況下，細胞質及細胞核中存在基礎水平pEGFRThr654的表達，我們分析在細胞正常培養條件下，培養基中含有多種激素類因子，其中包括EGF，激活EGFR配體依賴途徑，導致細胞在無輻射條件下存在pEGFRThr654，具體原因需進一步研究。此外，本研究考察了CNE-1細胞內核EGFR與DNA損傷修復相關蛋白DNAPK之間的聯系，結果證實了隨pEGFRThr654表達量增加，核內EGFR發生聚集，pDNA-PKThr2609的表達隨即增加，二者呈現正相關性，揭示核EGFR激活DNA損失修復相關蛋白DNA-PK是其介導鼻咽癌細胞輻射抵抗的機制之一。因此，阻斷EGFR核轉位將是降低由DNA-PK磷酸化介導的鼻咽癌放療抵抗的重要抑制靶點。

研究表明，核EGFR的促進細胞生成和促進放療誘導的腫瘤細胞DNA損傷后修復功能，是造成腫瘤細胞放療抵抗的重要原因之一。因而針對核內EGFR的分子靶向治療具有重要的實際意義，如阻斷EGFR核運輸、或阻斷核內EGFR下游信號轉導通路將成為有效的新的治療策略。西妥昔單抗(Cetuximab，C225)，是人鼠嵌合單克隆抗體，被認為是抑制EGFR受體激活和信號轉導以及誘導受體內吞和下調的藥物，有研究認為C225可以抑制EGFR核轉位，進而降低細胞核內DNA-PK的活性，增強腫瘤細胞的放療敏感度［15］，但在多種核EGFR高表達的腫瘤細胞株中發現C225可激發EGFR核轉位并可能引起耐藥［15-18］，導致 C225在EGFR核轉位中觀點矛盾的原因可能與不同因素誘導EGFR磷酸化位點不同有關。相對于蛋白質類大分子藥物，肽類藥物在人體中的作用已引起科學界的高度重視。小分子的腫瘤抑制肽具有結構易于改造，人工化學合成的生產成本較低，可以多種方式給藥，不易引起免疫反應等特點。根據研究發現EGFR的核定位序列(NLS)中Thr654磷酸化在放療介導的EGFR通過核質蛋白途徑入核中具有關鍵作用，選擇Thr654磷酸化的短肽(RKRT(PO3H2)LRRLK)可作為與EGFR上的NLS競爭核質轉運受體蛋白結合位點的抑制分子，有效阻斷EGFR核轉位［2］。本研究分別觀察抑制肽及對照肽對輻射誘導鼻咽癌CNE-1細胞內EGFR核轉位的影響，結果發現在輻射早期經過抑制肽處理的細胞核中EGFR及pEGFRThr654蛋白表達呈現少量增加趨勢，隨后逐漸降低。我們推測抑制肽在預處理細胞16h中，與細胞質中基礎水平的pEGFRThr654競爭與輸入素α結合，在放射初期，隨著細胞質中EGFR Thr654磷酸化水平增加，抑制肽與輸入素α的結合平衡受到影響，發生少量核轉位，或者EGFR也可通過非NLS與輸入素結合途徑發生核轉位，具體原因需進一步研究。通過觀察總體趨勢，我們認為抑制肽能夠有效抑制EGFR核轉位及其入核后的DNA修復相關活動。因此，通過阻斷pEGFRThr654介導的入核通路，可以實現靶向抑制EGFR核轉位，降低DNA-PK參與的DNA損傷修復作用，增加腫瘤細胞放射敏感性。

綜上，我們初步得出結論認為:輻射能夠誘導鼻咽癌CNE-1細胞內EGFR核轉運，并且EGFR核轉運可能由T654位殘基磷酸化介導并和DNA損傷修復等輻射耐受作用相關。通過靶向阻斷EGFR的核轉位可以消除EGFR-DNA-PK復合物的相互作用，抑制DNA損傷修復，減少細胞的存活。鑒于EGFR在多種腫瘤中高表達，這種機制可能具有腫瘤組織或細胞特異性，是一種非常有前景的治療靶點，開發靶向EGFR或其下游信號的阻斷劑聯合放化療一體化治療有重要的臨床意義和應用前景。

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