UHRF1、Ki-67蛋白在結腸癌中的表達及預后分析

艾曉晴，賈喜花，王曉博，鄭淑君，趙 霞

(保定市第一中心醫院，河北保定071000)

泛素樣含PHD和環指域1(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1)是最新發現的一種與細胞生長有關的核蛋白基因，參與了細胞增殖、周期調控、凋亡及放射敏感性等重要的生物學過程。最近的研究表明，UHRF1在調控細胞的增殖及細胞周期G1/S的轉換中起到重要的作用［1-2］，UHRF1蛋白在靜止的細胞中表達較低，而在增殖的細胞中表達明顯增加［3］。Ki-67蛋白是與細胞分裂增殖有關的一種蛋白，Ki-67在細胞內表達上與UHRF1相似，也在靜止期細胞不表達，而在增殖細胞中廣泛表達。結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升的趨勢，本文旨在研究UHRF1和Ki-67在結腸癌組織中的表達情況及其兩種蛋白的相關性，并探討其臨床意義及預后價值。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集2011年1月～2012年12月保定市第一中心醫院外科手術切除并經病理診斷的原發性結腸癌組織70例，均為腺癌。男38例，女32例，年齡28～83歲，中位年齡60歲，術前均未行放、化療及生物靶向治療等，按美國癌癥聯合會(AJCC)制定的TNM病理分期標準:Ⅰ～Ⅱ期49例，Ⅲ～Ⅳ期21例。高分化29例，中分化31例，低分化10例。取癌旁正常組織標本30例(距腫瘤邊緣＞5cm的正常組織)。

1.2 試劑

鼠抗人UHRF1單克隆抗體(1∶150稀釋，購自美國Abcam公司);兔抗人Ki-67單克隆抗體(1∶100稀釋，購自美國Abcam公司);通用免疫組織化學SP試劑盒和DAB顯色試劑購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 免疫組化的方法

應用免疫組織化學方法，采用EnVision二步法，以PBS替代一抗作為陰性對照。將組織石蠟切片置于65℃烤箱中烤2h，常規脫蠟至水，用蒸餾水洗兩次，室溫孵育。30%H2O2室溫孵育15min，以消除內源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min。高壓抗原修復:將切片浸泡在枸櫞酸鹽緩沖液中，用不銹鋼壓力鍋進行抗原修復，待不銹鋼壓力鍋噴氣時，計時2～3min，PBS沖洗，5min×3次。滴加鼠抗人UHRF1單克隆抗體(用PBS液按1∶150)稀釋，4℃孵育過夜;PBS沖洗，5min×3次;滴加HRP標記二抗工作液50μl，室溫孵育60min;PBS沖洗，5min×3次，DAB顯色試劑盒顯色，顯微鏡下觀察，用蒸餾水洗滌終止顯色反應，蘇木素復染，1%酒精鹽酸分化，自來水返藍，蒸餾水洗滌，脫水、透明、封片。Ki-67染色免疫組化方法同上。

1.4 免疫組化結果的判斷

評價標準各組染色切片在雙盲情況下由兩名病理科資深醫師觀察評價結果。UHRF1陽性結果判定［4］:UHRF1陽性染色細胞構成比為0評為0分，＞0～25%為1分，≥25%～50%為2分，≥50%～75%為3分，≥75%為4分。無陽性著色為0分，淺黃色染色為1分，淺黃色和棕黃色之間染色為2分，深黃色染色為3分。以上2項的乘積做為最終評分，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。Ki-67陽性結果判定［5］:Ki-67增殖指數(PI)值計算:Ki-67以腫瘤細胞核染色為陽性，在高倍鏡(×400)下選取10個視野計算。Ki-67 PI值=(陽性腫瘤細胞數/總瘤細胞數)×100%，＜10%為陰性，≥10%為陽性。UHRF1主要定位于細胞質和細胞膜(圖1)，Ki-67主要定位于細胞核(圖2)。

圖1 UHRF1在結腸癌中的表達(SP×400)Figure 1 Expression of UHRF1 in colon cancer

圖2 Ki-67在結腸癌中的表達(SP×400)Figure 2 Expression of Ki-67 in colon cancer

1.5 隨訪

參閱患者在本院住院病歷整理生存資料，不在本院進行手術后續治療者，電話詢問患者家屬并整理患者生存資料。隨訪開始時間為術后第1天，末次隨訪或死亡時間以月為計量單位，隨訪至2015年2月。隨訪時間1～50個月，無失訪。

1.6 統計學方法

采用SPSS19．0進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗和獨立兩樣本t檢驗，相關性行Spearman等級相關分析，應用Kaplan-Meier方法進行生存曲線的描繪，中位生存時間用非參數檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UHRF1、Ki-67在結腸癌中及其癌旁組織中的表達

UHRF1在結腸癌中的陽性表達率為87．1%(61/70)，高于癌旁正常組織 56．7%(17/30)，差異有統計學意義(P＜0．05)。Ki-67在結腸癌中的陽性表達率為67．1%(47/70)，高于癌旁正常組織26．7%(8/30)，差異有統計學意義(P ＜0．05)，見表1。

2.2 UHRF1、Ki-67表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系

UHRF1和Ki-67在結腸癌中的表達均與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度無關，差異無統計學意義(P＞0．05)，而與TNM分期、浸潤深度及淋巴結轉移有一定相關性，TNM分期越晚，浸潤深度越深，它們陽性表達率越高，出現淋巴結轉移的結腸癌組織中，UHRF1、Ki-67陽性表達率均高于無轉移者，差異有統計學意義(P ＜0．05)，見表2。

2.3 UHRF1、Ki-67的表達在結腸癌中的關系

經Spearman相關分析可得，在結腸癌中UHRF1和Ki-67的表達呈正相關(r=0．367，P=0．002)，見表 3。

2.4 UHRF1、Ki-67的表達與患者預后的關系

Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，UHRF1陰性 3年生存率為 55．56%，UHRF1陽性和UHRF1、Ki-67 均陽性分別為 24．59% 和 24．44%，UHRF1陽性表達患者和UHRF1、Ki-67均陽性者3年生存率明顯較陰性者低(P=0．041，P=0．028)，差異有統計學意義，UHRF1、Ki-67均陽性表達患者的3年生存率比單獨UHRF1陽性表達者低(P=0．492)，但差異無統計學意義，見圖3。圖中亦可得知，UHRF1陰性患者的中位生存時間為37．33個月，UHRF1陽性者為 24．49 個月，UHRF1、Ki-67 均陽性者為 22．71個月，UHRF1陽性表達患者和UHRF1、Ki-67均陽性者中位生存時間明顯較陰性者短(P=0．007，P=0．004)，差異有統計學意義，UHRF1、Ki-67均陽性表達患者的中位生存時間比單獨UHRF1陽性表達者短(P=0．533)，但差異無統計學意義。

表1 UHRF1和Ki-67在結腸癌和癌旁正常組織中的表達Table 1 UHRF1，Ki-67 expressions in colon cancer and normal colon tissue

表2 UHRF1和Ki-67表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系Table 2 UHRF1，Ki-67 expressions and clinicopathologic features in colon cancer

表3 UHRF1和Ki-67表達在結腸癌的關系Table 3 Correlation of UHRF1，Ki-67 expressions in colon cancer

圖3 UHRF1和Ki-67表達與生存率的關系Figure 3 Relationship between expression of UHRF1，Ki-67 and survival rate

3 討論

表觀遺傳學是近些年來迅速發展的一門新興遺傳學分支學科，它研究在不涉及核苷酸序列改變的情況下，基因產生了可遺傳變化的生物學現象。其中組蛋白修飾和DNA甲基化是表觀遺傳學的兩個重要研究內容，它們在基因表達、X染色體失活、細胞調控、胚胎發育以及腫瘤發生等多方面都發揮重要的作用。UHRF1是近些年來表觀遺傳研究的熱點蛋白之一，在DNA甲基化的維持方面起重要作用。人UHRF1蛋白含有793個氨基酸并包括一個類泛素(ubiquitin-like)模式、一個亮氨酸拉鏈模式(leucine zipper motif)、鋅指模式(zinc finger motif)、一個eyelinA/E-CDK2磷酸位點、一個RB結合部位和一個指狀構造［6-7］。隨著對細胞周期調控的分子機制的深入研究發現，癌癥實際上是一類細胞周期調控異常所致的疾病，尤其是細胞周期G1/S調控的異常［8］。最近的研究表明，UHRF1在調控細胞的增殖及細胞周期G1/S的轉換中起到重要的作用［1-2］。UHRF1蛋白在靜止的細胞中表達較低，而在增殖的細胞中表達明顯增加［3］。增殖旺盛的腫瘤組織中UHRF1過表達，其包括的SRA結構域與DNA甲基轉移酶 1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)結合，使DNA甲基化，可抑制p16INK4、hMLH1、BRCA1和RB1等多種抑癌基因表達［9］。

UHRF1在乳腺癌、膀胱癌以及前列腺癌等腫瘤細胞中異常高表達，與腫瘤的浸潤和轉移密切相關［10-12］。有研究證實了UHRF1表達水平與腫瘤的分化程度、TNM分期、是否淋巴結轉移和是否遠處轉移密切相關，而與年齡和性別無關［4］。Raksha［13］等研究發現，UHRF1蛋白過表達與肝癌細胞的惡性表型如腫瘤大小、分化程度和微血管侵犯有關，UHRF1表達還與腫瘤的分級和分期有關。本實驗通過免疫組化的方法檢測顯示，UHRF1在結腸癌中的表達均明顯高于癌旁正常組織(P＜0．05)。TNM分期越晚，浸潤深度越深，它們陽性表達率越高，出現淋巴結轉移的結腸癌組織中，UHRF1、Ki-67陽性表達率均高于無轉移者，表明二者的陽性表達與結腸癌的浸潤和轉移有著密切相關。

Ki-67抗原為細胞核內分裂增殖相關蛋白，在細胞周期 S、G1、G2、M 期均有表達，G0 期缺如［14］，是目前應用最廣泛、最可靠的增殖細胞標志物之一［15］。關于Ki-67的研究已相當成熟，大量研究表明，Ki-67在幾乎所有腫瘤組織中高表達，且與腫瘤分期、淋巴結轉移等密切相關，已作為常規免疫組化因子應用于臨床病理，指導腫瘤臨床用藥及判斷預后。本研究中，Ki-67在結腸癌中的表達均明顯高于癌旁正常組織(P＜0．05)。TNM分期越晚，浸潤深度越深，有淋巴結轉移，其陽性表達率越高，這些均與既往大量研究結果一致。

本文在研究UHRF1、Ki-67的表達在結腸癌的關系中發現，UHRF1與Ki-67在結腸癌中表達呈正相關，差異有統計學意義(P＜0．05)，結果提示UHRF1與Ki-67在結腸癌的發生發展過程中存在一定相關性，這可能與腫瘤細胞處于增殖分裂狀態相關，因為UHRF1與Ki-67均在靜止期細胞不表達，而在增殖細胞中廣泛表達。另外，Geng［10］和Cui等［16］研究發現，UHRF1與多種腫瘤預后相關，UHRF1表達水平越高，患者的生存時間越短，其預后越差。本文中，Kaplan-Meier分析結果顯示，UHRF1陰性患者3年生存率為55．56%，UHRF1陽性和UHRF1、Ki-67均陽性的患者分別為24．59%和24．44%，UHRF1陰性患者的中位生存時間為37．33 個月，UHRF1 陽性者為 24．49 個月，UHRF1、Ki-67均陽性者為22．71個月。這表明，UHRF1陽性表達患者和UHRF1、Ki-67均陽性者3年生存率和中位生存時間明顯較陰性者低。UHRF1、Ki-67均陽性表達患者的3年生存率和中位生存時間有比單獨UHRF1陽性表達者稍低的趨勢，但差異無統計學意義，可能與樣本量小有關，有待于擴大樣本來進一步的研究證實。

綜上所述，UHRF1、Ki-67蛋白在結腸癌中高表達，并且其表達水平與腫瘤惡性行為和不良預后密切相關，可考慮作為結腸癌臨床評價腫瘤生物學行為及判斷預后的指標。另外，UHRF1作為一種重要的表觀遺傳學調控因子，與腫瘤的發生、發展及浸潤轉移關系密切，以UHRF家族蛋白為靶點的腫瘤靶向性治療有望在今后得到臨床應用。

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