omega-3多不飽和脂肪酸對人肺腺癌細胞H460及H1975細胞周期及細胞凋亡的影響

曾斯遜，李昌林，丁振宇，王 椿

(1．瀘州醫學院附屬醫院腫瘤科，四川瀘州646000;2．成都市第一人民醫院腫瘤二科，成都610000;3．四川大學華西醫院腫瘤中心，四川大學生物治療國家重點實驗室，成都610041;4．四川大學華西醫院內分泌代謝科，成都610041)

肺癌發病率及死亡率居于全球惡性腫瘤首位，嚴重威脅人類的生命健康。目前治療方式有手術治療，化療、放療及生物治療等，大部份病人就診時已屬晚期，無手術指征，對于轉移性肺癌患者化療為主要治療手段，但肺癌5年生存率始終徘徊在15%左右，且已達平臺期，很難再提高［1-2］，所以拓展思路，發展新的治療方式有重要意義。

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是指結構中含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18～22個碳原子的直鏈脂肪酸。通常分為omega-3和omega-6。其中omega-3 PUFAs主要包括二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(docosahex-oenoic acid，DHA)。人體不能合成omega-3 PUFAs。

PUFAs可促進多種惡性腫瘤如乳腺癌、肝癌、胰腺癌等細胞的凋亡且抑制細胞增殖。可能機制涉及影響生物膜的構成和功能、調節腫瘤細胞脂質過氧化，抑制癌基因編碼蛋白的表達和功能，抑制腫瘤新生血管形成及抑制癌細胞與內皮細胞粘附［3-5］。

李芳芳［6］等研究omega-3多不飽和脂肪酸脫氫酶基因fat-1在人肺癌細胞H460內的表達，該研究表明omega-3脫氫酶基因fat-1能有效抑制肺腺癌細胞。胡振東［7］等研究多不飽和脂肪酸不同組分抑制肺腺癌干細胞作用，該研究表明多不飽和脂肪酸各有效成分對肺腺癌細胞有不同程度的抑制作用，且隨濃度增加其抑制作用增加。有學者［8］發現和給予omega-6 PUFAs的小鼠比較，細胞周期抑制劑基因(P21)在給予omega-3 FUFAs的小鼠中更具有較高表達，該結果表明攝入較高量魚油(omega-3/omega-6比例高)對肺癌進展有抑制作用。本研究用DHA及EPA處理肺腺癌細胞H460及H1975，觀察EPA及DHA對腫瘤細胞的細胞周期及細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗細胞 人肺腺癌細胞株H460及H1975購自American type culture collection(ATCC美國模式培養物收藏中心)。

1．1．2 主要試劑 EPA 、DHA(美國Sigma公司)，CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8)(日本同仁)，細胞凋亡及細胞周期試劑盒(凱基生物公司)。EPA和DHA用二甲亞砜配制成濃度600mmol/L的貯存液，-80℃避光保存。RPM1-1640培養基(Thermo公司)，同時加入10%胎牛血清(草原綠野生物)及雙抗(100U/mL青霉素+100U/mL鏈霉素)。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養 肺腺癌細胞H460和H1975細胞均用10%胎牛血清及100U/mL青霉素+鏈霉素的1640培養基于37℃、飽和濕度、5%CO2的條件下，在培養箱內進行培養，隔天換液，3d傳代1次。

1．2．2 實驗分組 實驗藥物EPA及DHA按濃度分組，分為 25、50、100、150、200、300μmol/L 組，同時設立二甲亞砜(1%)陰性對照及吉西他濱(400μg/ml)陽性對照。

1．2．3 CCK-8檢測細胞活性 按CCK-8使用說明書進行操作。采用96孔培養板，貼壁細胞用0．25%胰蛋白酶進行消化，收集后計數，調整細胞濃度為1×104個/ml，并設置5個復孔，培養24小時，使細胞呈單層貼壁且處于對數生長期。根據實驗設計分組以不同濃度藥物加藥，繼續培養24、48和72小時，終止反應時每孔加10μl的CCK-8試劑繼續在37℃、飽和濕度、5%CO2條件下在培養箱內培養2小時，在酶標儀(Thermo Multiskan Mk3)波長450 nm條件下測定OD值。

1．2．4 細胞凋亡檢測 經不同濃度DHA(100、200、300μmol/L)及 EPA(200μmol/L)處理 24 小時，誘導細胞凋亡后，嚴格按照凱基生物細胞凋亡試劑盒說明書進行操作，將貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌細胞兩次(2 000rpm離心5min)收集1～5×105細胞;加入500ul的結合緩沖液懸浮細胞;加入5ul Annexin V-FITC混勻后，加入5ul碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，混勻;室溫、避光、反應5～15min;用Accuri C6流式細胞儀(BD公司)進行檢測。

1．2．5 細胞周期檢測 經不同濃度DHA(100、200 μmol/L)及 EPA(200μmol/L)處理24小時后，嚴格按照凱基生物細胞周期試劑盒說明書進行操作，收集培養的細胞懸液，1 500rpm離心5min，棄去上清液，保留約100μl殘留液，其中細胞數量大于2×105個;取培養單個細胞懸液50μl，加入到試管底部。加入 100μl試劑 A，室溫孵育 10min。加入100μl試劑B。加入150μl試劑C于上述試管中，室溫避光孵育10min。用BD Accuri C6流式細胞儀進行檢測。

1．2．6 Western-blot檢測 Survivin 在蛋白水平上的表達 離心收集細胞，提取細胞總蛋白，預冷PBS漂洗2次，棄上清，再次離心，去盡殘留液，將樣品置于冰上用添加含有cooktail蛋白酶抑制劑及PMSF的RIPA裂解液(均購自凱基生物)重懸細胞。樣品渦旋震蕩1min，冰上放置3 min，如此反復操作至細胞徹底裂解。用細胞超聲破碎儀超聲3～5次，每次3～5s。避免產生氣泡，冰上操作。13，000rpm，4℃離心15 min，收集上清，用BCA(凱基生物)法測定蛋白濃度。加入SDS上樣緩沖液(凱基生物)，離心5min，取上清。4～20%SDS-PAGE膠(上海willget biotech公司)電泳，恒壓電泳濃縮膠80V，10min，再恒壓電泳分離膠120V，80min電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處，即結束電泳。將PAGE膠中蛋白轉移至 PVDF 膜(Millipor，0．22 μm)上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2小時，TBST漂洗后加入兔抗人Survivin多克隆抗體(Cell Signaling Tecnology公司)，4℃孵育過夜，TBST漂洗后加入HRP-羊抗兔IgG抗體(華安生物)，室溫孵育1．5 h，用TBST漂洗，最后加ECL化學發光顯色液(Millipore公司)顯色。以β-actin(Cell Signaling Tecnology公司)作為內參。

1．2．7 統計學處理 采用SPSS 13．0進行統計處理，計量資料結果以±s，采用單因素方差分析和t檢驗進行統計學比較，以P＜0．05作為檢驗水準。

2 結果

2．1 DHA與EPA對人肺腺癌細胞活性的影響

用CCK-8法測定陰性對照組、吉西他濱組及DHA 、EPA 6 個不同濃度(25、50、100、150、200、300μmol/L)及不同時間點(24、48、72小時)對腫瘤細胞活性的影響。用吉西他濱處理腫瘤細胞后，腫瘤細胞活性可明顯降低(P＜0．001)。用DHA或EPA處理腫瘤細胞后，低濃度組對腫瘤細胞活性無明顯影響。用 200μmol/L、300μmol/L EPA處理H460及H1975細胞腫瘤細胞活性均下降(P＜0．001)，且300μmol/L 比200μmol/L 下降更明顯(P＜0．05);用 200μmol/L 、300μmol/L DHA 處理H460細胞后，腫瘤細胞活性均下降(P＜0．001)，且 300μmol/L比 200μmol/L下降更明顯(P＜0．05)。用200μmol/L DHA 處理 H1975細胞后，腫瘤細胞活性下降不明顯，用300μmol/L DHA處理H1975細胞后，腫瘤細胞活性明顯下降(P＜0．001)。隨著300μmol/L DHA處理腫瘤細胞的時間延長，腫瘤細胞活性下降(P＜0．05)。隨著300μmol/L EPA處理腫瘤細胞的時間延長，腫瘤細胞活性下降(P＜0．05)。而低濃度組DHA及EPA處理腫瘤細胞后，其細胞活性與時間無明顯相關性。(見圖1、表1～4)。

圖1 EPA和DHA對H460及H1975細胞活性的影響

表1 EPA對H1975細胞活性的影響(OD值)(± s，n=6，)

表1 EPA對H1975細胞活性的影響(OD值)(± s，n=6，)

注:*與對照組相比P＜0．001，#與對照組相比P＜0．05

24h 48h 72h對照組組別0．49 ±0．03 0．62 ±0．05 1．08 ±0．09吉西他濱 0．36 ±0．03* 0．25 ±0．02* 0．24 ±0．01*EPA 25 0．45 ±0．03 0．60 ±0．06 0．94 ±0．08#50 0．43 ±0．04# 0．59 ±0．07 0．87 ±0．09*100 0．46 ±0．03 0．55 ±0．07* 0．86 ±0．12*150 0．45 ±0．03 0．55 ±0．05* 0．78 ±0．13*200 0．30 ±0．04* 0．29 ±0．04* 0．30 ±0．17*300 0．21 ±0．01* 0．21 ±0．01* 0．23 ±0．00*

表2 EPA對H460細胞活性的影響(OD值)(± s，n=6，)

表2 EPA對H460細胞活性的影響(OD值)(± s，n=6，)

注:*與對照組相比P＜0．001，#與對照組相比P＜0．05

組別24h 48h 72h對照組1．36 ±0．18 2．06 ±0．17 2．40 ±0．11吉西他濱 0．73 ±0．07* 0．36 ±0．02* 0．38 ±0．01*EPA 25 1．34 ±0．09 1．49 ±0．12* 2．32 ±0．18 50 1．32 ±0．07 1．62 ±0．23* 2．39 ±0．18 100 1．39 ±0．09 1．66 ±0．16* 2．41 ±0．11 150 1．37 ±0．09 1．64 ±0．16* 2．36 ±0．18 200 1．01 ±0．19* 0．90 ±0．10* 1．61 ±0．15*300 0．22 ±0．00* 0．23 ±0．00* 0．24 ±0．00*

表3 DHA對H1975細胞活性的影響(OD值)(±s，n=6)

表3 DHA對H1975細胞活性的影響(OD值)(±s，n=6)

注:*與對照組相比P＜0．001，#與對照組相比P＜0．05

組別24h 48h 72h對照組0．46 ±0．07 0．94 ±0．08 1．13 ±0．06吉西他濱 0．37 ±0．03* 0．31 ±0．02* 0．23 ±0．02*DHA 25 0．50 ±0．06 0．77 ±0．05* 1．18 ±0．06 50 0．55 ±0．04# 0．78 ±0．05* 1．17 ±0．09 100 0．56 ±0．03# 0．78 ±0．02* 1．12 ±0．03 150 0．56 ±0．07* 0．79 ±0．09* 1．03 ±0．09#200 0．54 ±0．04# 0．60 ±0．06* 0．59 ±0．07*300 0．26 ±0．03* 0．24 ±0．01* 0．23 ±0．02*

表4 DHA對H460細胞活性的影響(OD值)(±s，n=6)

表4 DHA對H460細胞活性的影響(OD值)(±s，n=6)

注:*與對照組相比P＜0．001，#與對照組相比P＜0．05

組別24h 48h 72h對照組1．15 ±0．13 1．88 ±0．19 2．47 ±0．04吉西他濱 0．67 ±0．06* 0．39 ±0．03* 0．29 ±0．02*DHA 25 1．11 ±0．10 1．59 ±0．05* 1．87 ±0．30*50 1．09 ±0．08 1．57 ±0．02* 1．93 ±0．14*100 1．04 ±0．07 1．56 ±0．07* 1．81 ±0．25*150 1．01 ±0．09# 1．46 ±0．07* 1．87 ±0．20*200 0．97 ±0．15# 1．56 ±0．08* 1．97 ±0．08*300 0．34 ±0．06* 0．25 ±0．01* 0．27 ±0．05*

2．2 DHA及EPA對細胞凋亡的影響

當EPA、DHA濃度大于200μmol/L時，細胞活性明顯下降。且細胞活性隨著EPA、DHA濃度增加而降低。我們推測200μmol/L為EPA和DHA對細胞活性產生影響的最低有效濃度。在EPA和DHA的最低有效濃度下檢測EPA(200μmol/L)及DHA(100、200 μmol/L)對細胞無明顯的誘導凋亡作用。不同濃度 DHA(100、200、300μmol/L)對細胞進行處理，結果發現當DHA濃度為300μmol/L時具有明顯誘導細胞凋亡的作用。(見圖2)。

圖2 DHA或EPA對H460及H1975細胞凋亡的影響

圖3 DHA或EPA對H460及H1975細胞周期的影響

2．3 DHA和EPA對人肺腺癌H1975及H460細胞周期的影響

EPA 200μmol/L及不同濃度 DHA(100、200μmol/L)處理腫瘤細胞后，顯示:EPA 200μmol/L及DHA 100、200μmol/L對 H1975及 H460的細胞周期無明顯影響。見圖3。

2．4 survivin蛋白在H460及H1975腫瘤細胞中的表達

腫瘤細胞經不同濃度EPA和DHA處理24小時后，EPA 濃度分別為 100、200、300μmol/L 時survivin蛋白表達無明顯變化，DHA濃度為100、200μmol/L時處理腫瘤細胞后，survivin蛋白表達無明顯變化，400μmol/L EPA處理H460及H1975細胞后，腫瘤細胞survivin表達降低，DHA 300μmol/L、400μmol/L處理H460細胞后，腫瘤細胞survivin表達均降低，DHA 300μmol/L處理H1975細胞后，腫瘤細胞survivin表達降低。由于DHA 400μmol/L處理H1975細胞24小時后，細胞凋亡十分明顯，故400μmol/L濃度處理H1975 24小時后未收到survivin蛋白，因此H1975細胞實驗結果無400μmol/L DHA濃度組實驗結果。高濃度的EPA及DHA可抑制survivin在腫瘤細胞H460及H1975中的表達。見圖4。

圖4 DHA和EPA對肺腺癌細胞H460及H1975中Survivin蛋白表達的影響

3 討論

Omega-3PUFAs是一類重要的多不飽和脂肪酸，也是人體內必須的營養成分之一，與人類多種生理活動密切相關。omega-3PUFAs可降低心血管疾病的發生［9］。近年的研究發現，omega-3PUFAs可促進腫瘤細胞的凋亡及抑制腫瘤細胞增殖，但國內關于omega-3PUFAs對肺癌細胞的研究較少。

本研究以不同濃度和不同時間點的EPA和DHA作用于人肺腺癌細胞，用CCK-8方法測定腫瘤細胞活性，結果表明，低濃度omega-3PUFAs對人肺腺癌細胞無明顯作用，而高濃度omega-3PUFAs可抑制人肺腺癌細胞H1975及H460腫瘤細胞活性，提示高濃度EPA和DHA對人肺腺癌細胞H460及H1975有抑制作用。用流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡及細胞周期，結果表明，低濃度 omega-3PUFAs對腫瘤細胞凋亡無明顯影響，高濃度DHA可誘導腫瘤細胞的凋亡;omega-3PUFAs對人肺腺癌細胞H1975及H460的細胞周期無明顯影響。用western法檢測Survivin蛋白在H460及H1975腫瘤細胞中的表達，發現低濃度omega-3PUFAs對Survivin蛋白在H460及H1975腫瘤細胞中的表達無明顯影響，而高濃度omega-3PUFAs處理腫瘤細胞后，survivin表達減弱。

Kikawa［10］等通過增強電離輻射及補充 DHA誘導人肺腺癌細胞A549的氧化應激及細胞凋亡中發現:增強電離輻射及補充DHA能誘導人肺腺癌細胞A549的氧化應激及細胞凋亡，且聯合增強電離輻射及補充DHA比單獨采用上述方法的效果更佳。本實驗研究了 omega-3PUFAs對人肺腺癌細胞A549、H1975及H460細胞活性的影響，但我們發現omega-3PUFAs對A549的細胞活性無明顯影響(結果未展示)，而 omega-3PUFAs對人肺腺癌細胞H1975及H460的細胞活性有抑制作用。本研究與Kikawa KD研究結果不一致可能是由于檢測方法的差異所致，該研究使用胰蛋白酶消化后用臺盼藍染色計數，使用血細胞計數器對無污點的細胞計數，其結果表明DHA對A549細胞有明顯抑制作用，而用流式細胞術檢測細胞凋亡結果表明DHA對A549細胞的抑制作用不明顯，其差異可能是由于其系統誤差而導致。而本研究采用CCK-8試劑盒及酶標儀在波長450 nm條件下測定OD值，這種檢測方法的系統誤差相對前者較小。

本研究發現omega-3PUFAs處理腫瘤細胞后，survivin表達減弱，我們推測 omega-3PUFAs對H1975及H460的細胞凋亡作用機制可能與omega-3PUFAs改變腫瘤細胞survivin基因蛋白的表達相關。survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosisprotein，IAP)家族的成員。survivin表達于胚胎和發育的胎兒組織，且在大部分腫瘤如乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌以及膀胱癌中顯著表達，而在正常分化的組織中幾乎不表達。生物學上，survivin已經被證明能夠抑制細胞凋亡，促進腫瘤轉移和促進血管生成，其抑制凋亡的機制可能與survivin通過調控線粒體凋亡途徑發揮抗腫瘤細胞凋亡作用有關。關于survivin在肺癌中的表達目前報道較少。隨著癌前細胞向癌細胞的轉化，survivin的表達逐漸升高，survivin陽性提示組織學正常的組織存在癌變的可能，survivin表達隨腫瘤細胞分化程度降低而呈上升趨勢，預示肺癌有較高的浸潤性和不良預后。由于survivin在正常組織和腫瘤組織中的表達存在較大差異，目前survivin作為癌癥的預后指標及一個新的抗癌治療靶點成為一個研究熱點［11-14］。

李芳芳［6］等在研究中表明 omega-3PUFAs脫氫酶基因fat-1能有效抑制肺腺癌細胞，胡振東［7］等在研究中表明多不飽和脂肪酸各有效成分對肺腺癌細胞有不同程度的抑制作用，并隨濃度增加其抑制作用增加，以上兩個研究間接支持我們結果。而Zhang［15］等在研究中發現PUFA攝入對肺癌發生的風險沒有顯著影響，與本實驗結果不相似，該研究為meta分析，可能存在研究之間的異質性。

膳食中的PUFAs對人類惡性腫瘤發生、發展的影響已成為國內外的研究熱點，大量研究證實了不同比例omega-3PUFAs對惡性腫瘤的增殖具有不同程度的影響，從眾多調查研究來看，omega-3 PUFAs能夠降低惡性腫瘤發生的風險，有研究［16］發現omega-3PUFAs可通過促進細胞凋亡抑制胃癌細胞的生長。但是也有一些研究對omega-3 PUFAs能夠降低癌癥發生風險這個觀點提出了爭議，有學者［17］發現攝入omega-3 PUFAs與降低胃癌發生的風險并沒有相關性。

綜上所述，DHA和 EPA對人肺腺癌細胞H1975及H460細胞有明顯的抑制細胞活性及誘導細胞凋亡作用，但對細胞周期作用影響不明顯，其抑制細胞活性及誘導凋亡的作用機制可能與omega-3PUFAs改變了腫瘤細胞survivin蛋白的表達有關。但本研究未對omega-3PUFAs在人體內是否抑制肺腺癌細胞生長這個問題進行研究。該研究表明omega-3PUFAs對肺癌治療可能有潛在應用前景，值得進一步探索。

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