Nucleolin與VEGF在結(jié)腸癌中的表達及其與轉(zhuǎn)移的關(guān)系

林 冰，雷 晴，郎錦義，王春婷

(1．成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都610000;2．四川省腫瘤醫(yī)院，成都610041;3．四川大學(xué)，成都610000)

結(jié)腸癌是危害人類健康的常見消化道惡性腫瘤，全球結(jié)直腸癌發(fā)病率平均每年以2%速率遞增，老年人多見，但青少年也有逐年增多的趨勢［1］。在我國，隨著人民生活水平的不斷提高，結(jié)腸癌的發(fā)病率也在逐年增加，呈明顯上升趨勢，目前結(jié)腸癌已成為我國重點防治的腫瘤之一。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移機制非常復(fù)雜，包括癌基因的突變和過度表達，抑癌基因的缺失或突變等因素在結(jié)腸癌的演變過程中都起到了重要作用［2］。

血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種特異作用于內(nèi)皮細胞的多功能因子，在正常組織中表達水平較低，但是在許多腫瘤組織中表達水平較高，在腫瘤血管生成過程中起重要作用［3］。

Nucleolin廣泛存在于真核細胞的細胞核中，作為一個多功能核蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞增殖，胞質(zhì)分裂，細胞復(fù)制，胚胎發(fā)生等生命過程［4］。同時，Nucleolin在部分腫瘤細胞及內(nèi)皮細胞表面也呈高表達，近期的研究表明細胞膜表面的nucleolin參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［5］。此外，nucleolin與腫瘤發(fā)生及血管生成相關(guān)的一系列的配體結(jié)合，如hepatocyte growth factor、endostatin、tumor-homing peptide F3 、laminin、P-selectin、midkine等，通過功能性阻斷以及下調(diào)細胞膜表面的nucleolin，抑制內(nèi)皮細胞的遷移及血管生成，并引起內(nèi)皮細胞的凋亡［6］。有研究表明，nucleolin的核定位水平越高，膜定位水平越低，胰腺癌病人的預(yù)后越好，表明細胞膜表面的nucleolin可能作為一個潛在的腫瘤治療靶點［7］。

本文運用組織芯片技術(shù)，檢測Nucleolin蛋白在正常組織、結(jié)腸癌組織和淋巴結(jié)、肝臟轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中的表達情況，探討其與結(jié)腸癌病理分級、臨床分期之間的關(guān)系，及相關(guān)信號通路。

1 材料和方法

1．1 研究對象

組織芯片 結(jié)腸癌組織芯片(BC05115)購自陜西艾麗娜生物科技公司，含有結(jié)腸癌，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及各類組織微陣列，其中結(jié)腸癌30例，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移5例，結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，正常結(jié)腸、肝及淋巴結(jié)各3例，一例一點。陣列點直徑1．5mm，厚度5μm。詳細材料見表1．

1．2 免疫組織化學(xué)染色

一抗兔抗人nucleolin和兔抗人VEGF多克隆抗體，購自ProteinTech Group公司，采用1:250的比例稀釋。SP免疫組織化學(xué)法，以PBS液替代一抗做陰性對照，以試劑公司提供的陽性樣品做陽性對照。免疫組化結(jié)果采用OLYMPUS公司全自動顯微鏡照相裝置采集。光鏡下nucleolin和VEGF陽性表達主要呈棕色或棕黃色顆粒。評分標(biāo)準(zhǔn)采用半定量評分［8］:①按染色強度評分，基本不著色者為0分，著色淡者為1分，著色適中者為2分。②按照視野內(nèi)陽性細胞數(shù)，陽性率=陽性細胞/總細胞數(shù)×100%。＜5%為0分，5～25%為1分，26～50%為2分，＞50%為3分。以兩種評分的乘積作為免疫組化半定量得分，≤1分判定為陰性，≥2分判定為陽性。

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17．0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用X2檢驗對定性資料進行統(tǒng)計分析，以P=0．05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，P＜0．05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 Nucleolin和VEGF在正常結(jié)腸組織、結(jié)腸癌組織和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中的表達

光鏡下，VEGF陽性表達于細胞漿，在正常結(jié)腸組織、結(jié)腸癌組織和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中的平均評分為3．85 ±0．47、4．93 ±0．40 和6．80 ±0．70，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。VEGF在轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌中的表達顯著高于結(jié)腸癌(P＜0．05)。Nucleolin表達于細胞核、細胞漿和細胞膜，在正常結(jié)腸組織、結(jié)腸癌組織和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中的總評分分別為2．65±0．47、3．43 ±0．55、4．03 ±0．65，Nucleolin 總的表達水平在正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，但是在結(jié)腸癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)(見圖1)。

2．2 Nucleolin和VEGF的表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

VEGF在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中的表達顯著高于結(jié)腸癌(P＜0．05)，與患者年齡、性別無相關(guān)性(P＞0．05)，與組織的分化程度、TNM病理分期無相關(guān)性(P＞0．05)。總的Nucleolin的表達水平在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌與原位結(jié)腸癌中無顯著性差別(P＞0．05)，與患者年齡、性別無相關(guān)性(P＞0．05)，與組織的分化程度、TNM病理分期無相關(guān)性(P＞0．05)(見表1)。

圖1 Nucleolin和VEGF在正常組織和結(jié)腸癌組織中的表達情況

表1 Nucleolin和VEGF的表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2．3 Nucleolin在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸腺癌中亞細胞表達部位的改變及其與VEGF的關(guān)系

Nucleolin蛋白表達水平在結(jié)腸癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)，但是，與原發(fā)結(jié)腸癌相比，在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中，Nucleolin核著色減弱，胞漿和胞膜著色增強。VEGF在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中的表達水平顯著高于原位結(jié)腸癌組織(4．93 ±0．40，6．80 ±0．70，P=0．02)，且肝轉(zhuǎn)移灶中表達水平更高(見圖2)。這一結(jié)果提示，Nucleolin蛋白在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸腺癌中的亞細胞表達部位的改變可能和VEGF相關(guān)。

2 討論

結(jié)腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，隨著生活水平的提高，結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，已嚴重威脅人類健康。目前手術(shù)是結(jié)腸癌最有效的治療方法，結(jié)腸癌術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的相關(guān)并發(fā)癥是結(jié)腸癌患者的主要死因［2］。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程是多階段的、復(fù)雜的、具有高度選擇性的過程。它涉及腫瘤細胞本身與宿主之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系，腫瘤血管生成和宿主免疫系統(tǒng)的各種反應(yīng)，并受多種相關(guān)基因的調(diào)控，其確切機制尚未明了，是目前腫瘤研究的熱點和難點之一［9］。

VEGF在腫瘤形成和生長及在轉(zhuǎn)移瘤的形成中起著十分重要的作用，在許多人類腫瘤中，VEGF的表達水平與患者的生存期密切相關(guān)。VEGF的表達受到許多信號通路的調(diào)節(jié)，包括低氧、激素以及細胞因子的刺激。同時，也會取決于細胞的環(huán)境，如活化的癌基因的刺激［10］。

Nucleolin是真核細胞核仁中最主要的一種蛋白質(zhì)，可以調(diào)控核糖體的生物合成與成熟，細胞增殖生長、胚胎發(fā)生、胞質(zhì)分裂、染色體復(fù)制與核仁發(fā)生等過程［4］。腫瘤細胞表面的Nucleolin可作為細胞的受體，與多種配體相結(jié)合，參與腫瘤細胞的信號傳導(dǎo)［5-6］。已有文章報道，Nucleolin是血管內(nèi)皮抑素的新型功能性受體，血管內(nèi)皮抑素與新生血管的內(nèi)皮細胞膜上的Nucleolin高親和性結(jié)合后內(nèi)化，轉(zhuǎn)運入核，抑制Nucleolin的磷酸化，從而抑制血管內(nèi)皮細胞增殖的過程，抑制腫瘤新生血管生成［8］。同時，腫瘤細胞膜表面的Nucleolin也與胃癌和胰腺癌患者的預(yù)后相關(guān)［11］。

圖2 Nucleolin和VEGF在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸腺癌中發(fā)生表達改變

在本文中，我們采用結(jié)腸癌組織芯片，通過免疫組化方法檢測了Nucleolin和VEGF在結(jié)腸癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌和癌旁正常組織中的表達。結(jié)果顯示，VEGF陽性表達于細胞漿，在結(jié)腸癌組織和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常結(jié)腸組織(P＜0．05)，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中的表達顯著高于無轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織(P＜0．05)。Nucleolin主要表達于細胞核，也在細胞漿和細胞膜有部分表達，Nucleolin總的表達水平在正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，但是在結(jié)腸癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。VEGF和總的Nucleolin的表達水平與患者年齡、性別無相關(guān)性(P＞0．05)，與組織的分化程度、TNM病理分期無相關(guān)性(P＞0．05)。但是，在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中，Nucleolin核著色減弱，胞漿和胞膜著色增強。VEGF在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中的表達水平顯著高于原位結(jié)腸癌組織(P=0．02)，且肝轉(zhuǎn)移灶中表達水平更高，兩者變化趨勢一致，這一結(jié)果提示，Nucleolin蛋白從細胞核到細胞漿和細胞膜的轉(zhuǎn)位可能和結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，VEGF相關(guān)信號通路可能參與了這一過程。

綜上，Nucleolin蛋白胞核向胞膜的轉(zhuǎn)位與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，VEGF可能參與了這一過程，Nucleolin有望成為結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移治療的有效靶點。

［1］ Brenner H，Kloor M，Pox CP．Colorectal cancer［J］．Lancet，2014，26;383(9927):1490-502．

［2］ Ferlay J，Soerjomataram I，Ervik M，et al．Globocan 2012:Estimated cancer incidence，mortality and prevalence worldwide in 2012［EB/OL］．http://globocan．iarc．fr，2013．12．5．

［3］ Cimpean AM，Mazuru V，Saptefrati L，et al．Prox 1，VEGF-C and VEGFR3 expression during cervical neoplasia progression as evidence of an early lymphangiogenicswitch［J］．Histol Histopathol，2012，27(12):1543-1550．

［4］ 王慷慨，肖獻忠．核仁素在細胞增殖與細胞凋亡中的作用［J］．中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2004，29(6):707-710．

［5］ 蒙國照，肖勝軍，曾思恩，等．細胞表面核仁素表達下調(diào)抑制肝癌細胞生長［J］．中華腫瘤雜志，2011，33(1):23-27．

［6］ Christian S，Pilch J，Akerman ME，et al．Nucleolin expressed at the cell surface is a marker of endothelial cells in angiogenic blood vessels［J］．JCell Biol，2003，163(4):871 – 878．

［7］ Wise JF，Berkova Z，Mathur R，et al．Nucleolin inhibits Fas ligand binding and suppresses Fas-mediated apoptosisin vivo via a surface nucleolin-Fas complex［J］．Blood，2013，121(23):4729–4739．

［8］ Song N，Ding Y，Zhuo W，et al．The nuclear translocation of endostatin is mediated by its receptor nucleolin in endothelial cells［J］．Angiogenesis，2012，15(4):697 – 711．

［9］ Moustakas A，Heldin CH．Signaling networks guiding epithelialmesenchymal transitions during embryogenesis and cancer progression［J］．Cancer Sci，2007，98(10):1512-1520．

［10］ Chekhonin VP，Shein SA，Korchagina AA，et al．VEGF in tumor progression and targeted therapy［J］．Curr Cancer Drug Targets ，2013，13(4):423 – 443．

［11］韓亞楠，周 林，劉常浩，等．核仁素在胃癌組織芯片中的表達及其意義［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013，21(6):1280-1283．