海帶多糖對黃嘌呤氧化酶的抑制作用及對小鼠高尿酸血癥的調節*

焉翠蔚，李 晶，姜 柳，田友昊，常 寶

（中國海洋大學1.海洋生命學院；2.食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

近年來，中國高尿酸血癥患病率明顯上升，患者的發病年齡提前，呈年輕化趨勢。高尿酸血癥是一種因體內嘌呤代謝紊亂引起的代謝性疾病，其發病原因主要是由于機體內尿酸生成過多，排泄減少，或者二者同時作用［1］。高尿酸血癥是痛風的生化特征，據統計，大約有5%～12%的高尿酸血癥最終會發展成為痛風［2］。持續性的高尿酸血癥會引起高血壓、高血脂、心血管疾病、慢性腎病等并發癥的發生［3－5］。

目前用于高尿酸血癥臨床治療的藥物主要有2類：（1）降尿酸藥物，代表藥物為別嘌呤醇，主要通過抑制嘌呤代謝關鍵酶黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性，降低體內尿酸的含量；（2）促尿酸排泄藥物，此類藥物主要有丙磺舒、苯磺唑酮、溴苯馬隆，能夠幫助腎臟排出體內多余的尿酸［6］。別嘌呤醇是XOD的競爭性抑制劑，一直被作為一線藥物用于臨床高尿酸血癥和痛風的治療。在臨床上，別嘌呤醇存在一些嚴重的毒副作用，在一定程度上限制了其安全使用。目前，利用化學合成與微生物發酵的方法得到的XOD抑制劑雖然在體外對XOD具有良好的抑制作用，但都未能成功應用于高尿酸血癥的臨床治療。因此，從天然生物材料中尋找新型無毒高效的抗高尿酸血癥藥物已經成為目前抗高尿酸血癥藥物研究的熱點問題。

海帶多糖具有調節免疫、抗腫瘤、抗凝血、降血脂、降血糖、抗輻射、抗突變、抗體內氧化和耐缺氧等多種生物學活性［7］，但有關其調節體內XOD活性，降低血清尿酸水平的報道較少。本實驗研究了海帶多糖體外對XOD的抑制作用，并通過腹腔注射氧嗪酸鉀建立小鼠高尿酸血癥模型，研究海帶多糖對高尿酸血癥小鼠的降尿酸效果。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮海帶采購于青島市齊東路水產品市場，將清洗后的海帶用蒸餾水反復沖洗，烘干至恒重，粉碎，過60目篩，放入密封袋內貯存備用。

雄性昆明種小鼠60只，體重（33.0±2.2）g，購于青島市藥品檢驗檢疫所。

1.2 試劑和儀器

DEAE-52纖維素凝膠、Sephadex G-200葡聚糖凝膠為天津博迪化工股份有限公司產品；黃嘌呤（Xanthine）、黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，X1875）為Sigma公司產品；別嘌呤醇（Allopurinol）為上海寶曼生物科技有限公司產品；氧嗪酸鉀（Potassium Oxonate）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為北京華邁科生物技術有限公司產品；其它實驗試劑均采用國產分析純。

電子天平（FA1004型）；集熱式磁力攪拌機（DF-101S型）；高速冷凍離心機（HC-3018R型）；旋轉蒸發儀（N-1100型）；FT-IR紅外光譜儀（Nexus-470型）；紫外可見分光光度計（UV-2800型）；全自動血液生化分析儀（BS-200型）。

1.3 方法

1.3.1 海帶多糖的制備［8］稱取海帶干粉10g，以1∶40的料液比加入蒸餾水，70℃水浴浸提4.5h，離心，取上清；將上清液用旋轉蒸發儀真空減壓濃縮，Sevag法除去蛋白質［9］，加入95%乙醇4℃，靜置過夜，離心收集沉淀，分別用無水乙醇、丙酮反復洗滌沉淀，真空抽濾，冷凍干燥，得海帶粗多糖。采用DEAE-52纖維素離子交換柱和Sephadex G-200凝膠柱層析對海帶多糖進行分離純化［10］，收集最大洗脫峰，冷凍干燥得純品，所得海帶多糖為淡黃色粉末，易溶于水，不溶于如乙醇、丙酮等有機溶劑，苯酚－硫酸法［11］測定純化后海帶多糖的總糖含量為91.8%。參照文獻［1］方法，測得該多糖的相對分子量約為9.2×104。多糖酸性水解物經紙層析檢查［13］，發現多糖中含有巖藻糖、葡萄糖、半乳糖和木糖。

1.3.2 海帶多糖紅外光譜測定［14］取純化后的多糖樣品5mg，KBr研磨壓片后，在4 000～500cm－1的波數范圍內測定海帶多糖的紅外光譜圖。

1.3.3 體外海帶多糖對XOD活力的影響 XOD酶活力的測定原理是XOD能夠催化底物黃嘌呤產生尿酸，尿酸在波長294nm處有特征吸收峰。參照文獻［15］的方法，反應體系總體積為5mL，在試管中依次加入2.0mL底物黃嘌呤溶液，2.6mL磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH＝7.5）和0.2mL海帶多糖溶液（濃度分別是0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL），25 ℃水浴10min，再加入25℃預溫的酶液（4μg/mL）0.2mL，充分混勻，反應1min，用紫外分光光度計測定OD294值，每個樣品平行操作3次。以公式I（%）＝（1－B/A）×100%計算不同濃度海帶多糖對XOD的相對抑制率（I）。其中，A為不加抑制劑（海帶多糖）的XOD的活力，B為加入抑制劑后的XOD的活力。將海帶多糖濃度與抑制率進行線性回歸得回歸方程，計算抑制率為50%的海帶多糖濃度，即半抑制濃度（IC50）。

1.3.4 海帶多糖與別嘌呤醇對XOD的聯合抑制作用采用等毒法［16］，將海帶多糖與別嘌呤醇單獨使用時對XOD的抑制率分別達到25%時所需的劑量混合，測定二者的混合物對XOD聯合抑制率的大小（實測抑制率），預期抑制率為50%，根據下面的公式求出共毒系數，評價海帶多糖與別嘌呤醇的混合物對XOD的聯合抑制作用。

共毒系數＝（實測抑制率（預期抑制率）/預期抑制率）×100。

1.3.5 小鼠實驗分組和給藥［17］實驗小鼠購回之后于動物房中進行適應性喂養，室溫（23±2）℃，12∶12h明暗交替。小鼠自由攝食和飲水，7d后，將60只小鼠隨機分為6組，分別為正常組、模型對照組、別嘌呤醇組、海帶多糖高劑量組、海帶多糖中劑量組和海帶多糖低劑量組。

小鼠每天下午14：00灌胃給藥一次，正常組和模型對照組分別給等劑量的0.5%CMC-Na；別嘌呤醇作為陽性對照組按10mg/kg·d給藥；海帶多糖高、中、低劑量組分別按照1 000、500、250mg/kg·d的劑量給藥，連續給藥7d。末次給藥1h前，除正常組外，其余各組小鼠按照300mg/kg的劑量腹腔注射氧嗪酸鉀，抑制尿酸酶的活性，提高小鼠的血清尿酸水平，建立高尿酸血癥模型。給藥1h后，各組小鼠摘眼球取血，血液在室溫凝結0.5h，2 500g離心10min，分離血清，4℃保存待測。

1.3.6 血清尿酸水平的測定 取血清，由中國海洋大學校醫院采用全自動血液生化分析儀測定各組小鼠的血尿酸值，對結果數據進行組間差異性比較。

1.3.7 肝臟XOD活性測定［18］解剖小鼠，取肝臟低溫冷凍，加入5倍體積80mmol/L冰冷的焦磷酸緩沖液（pH＝7.4）進行組織勻漿。肝組織勻漿3 000g離心10min，去除脂層，剩余組織液繼續10 000g離心1h。取上清液用于檢測肝組織的XOD活力。

采用總體積為5.5mL的反應體系，加入3.6mL濃度為50mmol/L的磷酸緩沖液、100μL肝臟提取液、100μL濃度為1mmol/L的氧嗪酸鉀，37℃下反應15min。再加入1.2mL濃度為250μmol/L的黃嘌呤溶液，準確反應10min，最后加入0.5mL 0.58mol/L HCl溶液終止反應。將反應液3 000g離心5min，取上清液，在294nm下測定OD值。

1.4 數據處理

實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行數據處理和統計分析，結果以平均值±標準偏差（珡X±S）表示。采用單因素方差分析進行各組樣本平均數的比較，P＜0.05說明組間差異顯著，具有統計學意義；P＜0.01說明差異極顯著，具有統計學意義。

2 結果及分析

2.1 海帶多糖紅外光譜測定結果

海帶多糖的紅外掃描圖譜見圖1，圖譜顯示海帶多糖具有多糖物質的特征吸收峰，其中3 288cm－1是—OH的伸縮振動，2 938cm－1是C—H 伸縮振動，1 320～1 372cm－1是C—H變角振動，1 261cm－1處是SO振動引起的，表明多糖中存在硫酸基［19］，1 196cm－1為糖環內C—O的伸縮振動，1 019和1 082 cm－1是醇羥基—OH 的變角振動［20］，883和927cm－1為β-吡喃環C—H變角振動［21］，表明多糖中含有β－糖苷鍵。

2.2 體外海帶多糖對XOD活力的影響

不同濃度海帶多糖對XOD活力的影響結果見圖2，當海帶多糖濃度處于0～0.6mg/mL范圍內時，海帶多糖對XOD的抑制率隨著濃度的增大而迅速升高；而當海帶多糖濃度≥0.6mg/mL時，隨著海帶多糖濃度的升高，抑制率的增長趨于平緩。經過計算，海帶多糖的半抑制濃度IC50為0.88mg/mL。

圖1 海帶多糖的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectroscopy of Laminaria japonica polysaccharides

圖2 不同濃度海帶多糖對XOD活力的影響Fig.2 Effects of Laminaria japonica polysaccharides on the activity of XOD

2.3 海帶多糖與別嘌呤醇對XOD的聯合抑制作用

將海帶多糖與別嘌呤醇單獨使用時對XOD抑制率分別達到25%時的劑量進行混合。聯合抑制作用結果顯示，海帶多糖與別嘌呤醇的混合物對XOD的實測抑制率為（63.11±1.54）%，明顯高于預期抑制率（50%），其共毒系數為26.22±3.08，大于20，根據共毒系數理論，海帶多糖與別嘌呤醇的二元混合物對抑制XOD活性具有協同作用，說明二者的聯合使用可以有效提高對XOD的抑制率。

2.4 海帶多糖對高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響

不同劑量海帶多糖和別嘌呤醇灌胃7d后對高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響結果見表1。氧嗪酸鉀腹腔注射小鼠預處理后，與正常組小鼠相比，模型對照組小鼠的血清尿酸水平顯著提高，達極顯著水平（P＜0.01），說明高尿酸血癥小鼠建模成功。別嘌呤醇組血尿酸值比模型對照組低65.65%，比正常組低36.68%，均達極顯著水平（P＜0.01），證明別嘌呤醇具有明顯的降尿酸效果。海帶多糖高、中、低劑量組小鼠血尿酸值與模型對照組相比分別降低了43.03%、35.89%和27.72%，其中高、中劑量組降尿酸效果達極顯著水平（P＜0.01），可見，實驗劑量的海帶多糖均可降低高尿酸血癥小鼠的血尿酸水平，并且呈現良好的劑量依賴關系。海帶多糖高、中劑量組的血尿酸值雖然仍高于正常組，但差異不顯著（P＞0.05），說明海帶多糖對氧嗪酸鉀所致的高尿酸血癥具有明顯的改善作用。

表1 海帶多糖對高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響Table 1 Effects of Laminaria japonica polysaccharides on serum urate levels in hyperuricemic mice

2.5 海帶多糖對小鼠肝臟XOD活力的影響

由表2可見，模型對照組小鼠腹腔注射氧嗪酸鉀后肝臟中XOD的活性顯著高于正常組（P＜0.01）。別嘌呤醇對高尿酸血癥小鼠肝臟中的XOD具有極強的抑制作用（P＜0.01），XOD活性降低了46.15%，已經低于正常組小鼠酶活水平。經過不同劑量海帶多糖灌胃的高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD的活性比模型對照組降低了8.73%～17.46%，其中海帶多糖高、中劑量組能夠顯著降低高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD的活性（P＜0.05），并且與正常組小鼠相比差異不顯著（P＞0.05）。可見，不同劑量的海帶多糖與別嘌呤醇對高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD的活性都存在抑制作用，但海帶多糖的抑制作用比別嘌呤醇溫和，可使高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD的活性基本恢復正常。

表2 海帶多糖與別嘌呤醇對高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD活性的抑制作用Table 2 Inhibition of XOD activities in hyperuricaemic mice by administration of Laminaria japonica polysaccharides and allopurinol

3 討論

XOD是嘌呤代謝過程中的關鍵酶，主要分布在肝臟與小腸中，能夠催化機體內的次黃嘌呤生成黃嘌呤，并進一步氧化生成尿酸，體內XOD活性的升高，與高尿酸血癥的形成有密切的聯系［22］。黃嘌呤氧化酶抑制劑可抑制XOD的活性，阻礙機體內尿酸的合成，起到降尿酸的效果，用于治療高尿酸血癥。目前，已經上市應用最為廣泛的一類黃嘌呤氧化酶抑制劑是別嘌呤醇，別嘌呤醇是XOD的一種自殺性底物，與底物競爭性結合XOD的活性位點Mo－pt，使XOD喪失催化活性，對XOD有極強的抑制作用，但在臨床治療中會產生很多毒副作用，如發熱、過敏性皮疹、腹瀉、肝功能損害、白細胞和血小板減少等副作用，限制了該藥的廣泛使用［23］。本實驗結果表明海帶多糖在體外對XOD具有明顯的抑制作用，其抑制率隨著海帶多糖濃度的增大而升高，二者呈現一定的劑量依賴關系，雖然對XOD的抑制作用比別嘌呤醇弱，但海帶多糖與別嘌呤醇對XOD表現為協同聯合抑制作用，其共毒系數＞20，說明二者在對XOD的抑制作用過程中起到互相增強的效果，聯合使用海帶多糖和別嘌呤醇優于二者單獨使用。

海帶多糖與別嘌呤醇對高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響研究結果表明，別嘌呤醇能有效降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平，但其過強的藥效使得血尿酸值低于正常水平。尿酸水平不僅是體內嘌呤代謝穩定的標識，還可能具有其他的生物化學功能。Burkhardt［24］發現，尿酸具有抗氧化的作用，Singhet［25］發現，尿酸具有防止DNA損傷的功能。因此，過度降低體內的尿酸水平可能會適得其反，造成機體的其他不良反應，本實驗中觀察到別嘌呤醇組多數小鼠毛色發暗，精神比較萎靡，尿量明顯增多。海帶多糖各實驗劑量組與模型對照組相比都起到有效的降尿酸效果，并且呈現良好的劑量依賴效應。其中海帶多糖高、中劑量組血清尿酸值與正常組小鼠相比無顯著差異，基本恢復至正常水平。實驗過程中海帶多糖各劑量組小鼠生長狀況、精神狀態良好，與正常組小鼠相比均無明顯差異，體重增長穩定，無死亡現象，證明海帶多糖在飼喂過程中對小鼠的正常生長未產生影響，海帶多糖在作為抗高尿酸血癥藥物方面是安全可靠的。同時，海帶多糖高、中劑量組能夠有效降低高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD的活性，使其基本恢復至正常水平，說明海帶多糖可能通過抑制肝臟內XOD的活性起到降尿酸的效果，其具體作用機制還需進一步研究。

4 結語

本研究發現，海帶多糖在體外對XOD具有明顯的抑制作用，海帶多糖與別嘌呤醇對XOD表現為協同聯合抑制作用，盡管海帶多糖對XOD的抑制作用比別嘌呤醇弱，但海帶多糖對氧嗪酸鉀所致的小鼠高尿酸血癥有明顯的降尿酸效果，并對小鼠肝臟中XOD抑制作用顯著，同時安全無毒副作用，有望為今后抗高尿酸血癥藥物的開發提供新的材料。

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