長江干流浮游植物群落結構的DGGE分析*

孫 靜，甄 毓，米鐵柱**

（1.中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室，山東 青島 266100；2.聊城大學生命科學學院，山東 聊城 252000）

長江是中國第一大河，研究長江干流的浮游植物生物多樣性具有重要意義。長江三峽水利樞紐工程（三峽工程）是世界上最大的水電水利樞紐工程，它的建成在產生巨大綜合效益的同時，也改變了生源要素的時空分布，使得浮游生物的組成和數量發生改變，進而影響整個水生態系統的結構，對庫區、下游、乃至近海的生態與環境帶來了廣泛而深遠的影響。

三峽大壩建成以后，長江水體原來的水文環境發生了巨大改變：庫內水流變緩，透明度顯著升高，水體滯留時間大大延長，加上較高的營養鹽濃度更適宜藻類的生長，增加了藻華暴發頻率。因而，近年來，有關長江浮游植物分布特征的研究受到了越來越多的生態學家關注。但這些研究多專注于長江口及其臨近海域、三峽庫區［1－7］，而對整個長江干流水域的研究則較少［8－9］。本研究運用變性梯度凝膠電泳技術（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE），針對浮游植物18SrDNA基因，對2006年4及9月長江干流涪陵以下25個站位的浮游植物多樣性進行了研究，對浮游植物的總體分布格局及其與環境因子的關系進行了探討。

1 材料與方法

1.1 調查區域及樣品采集

2006年4 、9 月分別對長江干流的25個站位進行樣品采集工作（采樣站位見圖1）。一部分水樣首先用200目的篩絹過濾，然后將過濾后的江水用0.45μm孔徑的硝酸纖維素膜過濾，將濾膜轉移至2mL離心管中，置于－20℃保存，用于浮游植物群落多樣性的分析。另一部分水樣用孔徑0.45μm的聚醚砜濾膜過濾（濾膜預先在1∶1 000HCl中浸泡48h以上，后用超純水清洗數遍，45℃烘干，備用），濾液裝于2個100mL聚乙烯瓶中（樣品瓶預先在1∶5HCl中浸泡48h以上，后用超純水清洗數遍，然后包上潔凈的塑料袋，備用），其中一份－20℃冷凍保存，用于測定硝酸鹽（NO3－N）、氨氮（NH4－N）、磷酸鹽（PO4－P）濃度；另一份加入1滴氯仿常溫避光保存，用于測定硅酸鹽（SiO3－Si）濃度。

1.2 DNA的提取

參照Sinha等［10］的方法并進行改進。用500μL TE緩沖液（10mol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA）懸浮藻細胞；加入600μL預熱到55℃的抽提緩沖液（3%CTAB，1%Sarkocyl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl，1% α-Mercaptoethanol），55℃處理60min；加入1mL氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），14 000r/min，4℃離心10min；小心取上清液，加入1/10體積的醋酸鈉（3mol/L，pH＝5.3）和2倍體積的冰冷無水乙醇，放置于－20℃使DNA沉淀2h，14 000r/min，4℃離心10min；70%乙醇洗滌2次；真空抽干，40μL TE緩沖液溶解。

1.3 PCR及瓊脂糖電泳檢測

PCR擴增所用引物為真核生物通用引物F1427（5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCC-CCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG）和R1616（5’-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG）［11］。PCR擴增程序為94℃，5min；94℃變性30s，52℃退火1min，72℃延伸90s，30個循環；72℃延伸10min。用1%的瓊脂糖凝膠對PCR 產物進行電泳檢測。

圖1 長江干流2006年4月、9月樣品采集站位圖Fig.1 Sampling stations

將5μL擴增的產物與1μL上樣緩沖液混合后上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳，100V恒壓電泳30min，在含0.5μg/mL溴化乙錠的1×TAE緩沖液中染色10～30min，用凝膠成像系統進行拍照。

1.4 DGGE分析

采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統對PCR反應產物進行DGGE分析。DGGE電泳條件為：10%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從30%到55%，150V，1×TAE緩沖液中電泳8h。電泳完畢后，將凝膠置于0.5μg/mL溴化乙錠溶液中震蕩染色20min，凝膠成像系統拍照。

1.5 主要理化因子的測定

本研究所用硝酸鹽、氨氮、磷酸鹽、硅酸鹽濃度均利用AAIII型營養鹽自動分析儀（德國BRAN＋LUEBBE公司）進行測定；懸浮顆粒物（SPM）的含量利用差重法測得。

1.6 圖像處理及數據分析方法

使用Quantity One軟件對圖像進行處理。將圖像的背景扣除后，對條帶進行自動檢測，然后手動進行確認。基于DGGE圖譜，采用非加權配對算數平均法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic averages，UPGMA）對各站位間的相似性進行聚類分析。根據各條帶的亮度，運用以下公式計算Shannon-Weaver多樣性指數（H）

式中：ni為每條帶的亮度峰值；N為每個泳道中所有條帶亮度峰值的和［12］。

利用Canoco軟件（version 4.51）進行典范對應分析（Canonical correspondence analysis，CCA）以揭示物種多樣性和環境因子的關系［13］。主要過程為用automated forward selection method去除variance infla-tion factor（VIF）大于20的環境因子，利用 Monte Carlo permutation test（499permutations）選擇與物種組成顯著相關的環境變量。

2 結果與分析

2.1 PCR產物的瓊脂糖電泳檢測

PCR擴增產物的大小約為230bp。從圖2可以看出，每個站位的DNA提取物經PCR擴增后均得到了一條特異性條帶。說明該對引物具有較好的特異性，擴增產物適合用于DGGE分析。

2.2 DGGE分析結果

從DGGE電泳圖譜來看（見圖3），2006年4、9月份長江干流各觀測站均呈現較高的浮游植物多樣性：4月份各站位共呈現42條不同的條帶，各站位之間無共有條帶及特有條帶，豐都與鎮江浮游植物多樣性最低，DGGE條帶數為14，而巫山條帶數高達27，幾乎為豐都及鎮江的2倍；9月份各站位共39條不同條帶，僅有2條帶是各站位的共有條帶，浮游植物多樣性在各站位間的變化也比較顯著，條帶數介于11（涪陵）～26（大通）之間（見圖4）。除云陽鎮、南津關、大通和南京外，其余各采樣點4月份與9月份的浮游植物多樣性較為相近。

基于Dice相似系數，采用UPGMA聚類分析的方法，對4、9月份DGGE圖譜相似性進行分析。從圖5可以看出，4月份各站位的聚類結果與9月份極為相似，基于各站位的物種組成聚類的結果很好地反應了它們所屬站位的空間分布格局。4月份長江干流各站位聚為3類，3類站位分別位于三峽庫區、長江中下游及感潮河段。第一類又分為3個小的分支：涪陵、豐都、忠縣和萬州這4個站位均位于上游河段；云陽鎮、奉節、巫山和巴東4個站位位于三峽庫區的尾部；云陽、新灘鎮和香溪3個站位聚在一起，組成1個小的分支。第二類中的10個站位也分為3個小的分支：三斗坪（壩下）、南津關、葛洲壩下、荊州和監利5個站位均緊鄰三峽大壩；洪湖、漢陽和黃石3個站位均位于洞庭湖的下游附近；城陵磯和安慶分別位于洞庭湖與鄱陽湖的出口。第三類群包括位于鄱陽湖下游的鎮江、大通、南京和江陰4個站位，DGGE圖譜相似性系數最高，說明這幾個站位所揭示的浮游植物多樣性最為相似（見圖5A）。

圖2 長江干流2006年4、9月浮游植物樣品PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of phytoplankton samples from the Yangtze River in April and September 2006

圖3 長江干流2006年4、9月浮游植物樣品PCR擴增產物的DGGE指紋圖譜Fig.3 Denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）fingerprints of phytoplankton samples from the Yangtze River in April and September 2006

9月份各站位共聚為4類，其中4類中的3個類群基本和4月份相同，且各類群間的相似性高于4月份。與4月份所不同的是，涪陵與豐都2個采樣點單獨聚為一支，與其它各站位的相似性較低（見圖5B）。

2.3 CCA分析結果

首先用軟件Canoco進行DCA分析，結果表明最大梯度值分別為2.554和2.022（＞2.0），且經驗證，本研究中所有理化因子的VIF值均＜20，因此選擇典范對應分析對4、9月份樣品進行分析，從而進一步探討DGGE所揭示的物種多樣性和相關環境因子的關系（見圖6）。

圖4 2006年4月及9月各采樣點的DGGE圖譜條帶數Fig.4 Numbers of DGGE bands for each sampling station in April and September 2006

圖5 基于DGGE圖譜的UPGMA聚類分析結果Fig.5 Results of UPGMA cluster analysis based on DGGE patterns

第一軸反映的浮游植物組成與環境因子的相關性系數較高（見表1），分別為0.955（4月）和0.899（9月）；前兩軸的浮游植物組成與理化因子的特征參數累積變化率達到71.7%（4月）和71.9%（9月），說明浮游植物多樣性與本研究中所涉及的理化參數具有較好的相關性。表1中還列出了由CCA分析得到的各環境因子與前兩軸的相關系數。可以看出，硅酸鹽與2個月的浮游植物組成具有較強的相關性，相關系數分別為0.770 2（4月）和0.863 2（9月）。4月份浮游植物組成還與懸浮顆粒物相關性較強，懸浮顆粒物與第一軸的相關系數僅次于硅酸鹽，為0.746 7；而氨氮則與9月份浮游植物組成相關性較強，與第一軸相關系數為－0.717 0。此外，磷酸鹽和懸浮顆粒物分別在4和9月份的浮游植物組成中也起著重要作用，與第二軸的相關性系數較大。可見，CCA分析能夠很好地反映浮游植物多樣性與理化因子的關系。

3 討論

本研究運用DGGE技術對2006年平水期（4月）及豐水期（9月）長江干流的浮游植物多樣性進行了研究。結果表明，4與9月各站位的條帶數差異并不大，各站位間的共有條帶很少，說明整個長江干流浮游植物類群存在較大的差異，浮游植物種類較為豐富。9月份大多數站位的浮游植物種類要多于4月份；位于庫區的站位與其它站位相比，浮游植物種類并未呈現明顯偏高的趨勢。

圖6 環境變量與DGGE揭示的物種區域多樣性的CCA分析Fig.6 Canonical correspondence analysis biplot of species regional differences revealed by DGGE fingerprints constrained to environmental variables

表1 CCA分析結果總結Table 1 Summary results of the canonical correspondence analysis

DGGE技術在對微生物多樣性研究中的有效性已經得到了很好的印證［14－16］，而利用這一技術對浮游生物時空分布研究尚不多見：Yan等［17］運用DGGE技術對東湖的浮游生物群落多樣性進行了研究，Sun等［18］對東黃海浮游植物的分布進行了研究；研究結果均表明浮游生物群落組成的DGGE圖譜可以很好地反映其相應的生態環境。在本研究中，基于各站位浮游植物組成進行聚類的結果與它們在長江干流的分布格局基本是一致的（見圖5）。4月份，各個站位共聚為3大類，三類站位分別位于三峽庫區，長江中下游及感潮河段。其中第一類又分為3個小的分支：涪陵，豐都，忠縣和萬州均位于上游河段，此處的生態環境更接近于自然江段；云陽鎮，奉節，巫山和巴東4個站位位于三峽庫區的尾部，由于三峽庫區2006年蓄水至156m，此處的水位已有抬高，流速減慢，為浮游植物提供了有利的生長環境；云陽，新灘鎮和香溪3個站位處的水位也被抬高，但同時均有小的支流匯入，導致這里的浮游植物群落發生了變化，并且在采樣期間發現有水華的發生，所以這3個站位在聚類分析時聚為一支。第二類中的10個站位也分為3個小的分支：三斗坪（壩下），南津關，葛洲壩下，荊州和監利5個站位均位于三峽大壩的下游，經過大壩的截留效應，使這里的水文特征不同于上游河段，具有了自己較為獨特的浮游植物組成；洪湖，漢陽和黃石位于洞庭湖的下游，這幾個站位的江面比較開闊，流速緩慢，更有利于浮游植物的生長；而城陵磯和安慶分別位于洞庭湖與鄱陽湖的下游，由于與2湖的距離較近，2個站位受2湖的影響較為顯著，此處的浮游植物部分來自于2湖，故2個站位具有更多的相似性。而9月份聚類分析的結果與4月份略有不同，涪陵與豐都獨自聚為一支，與其它站位的相似性較低，初步推測可能是由于9月份過高的懸浮顆粒物濃度所致（見圖7）。對于長江而言，泥沙等懸浮物是影響水體透明度的主要因素，而水體的透明度直接影響了浮游植物的生長。此外，9月份長江處于豐水期，徑流量大，此時在4月份受兩湖影響比較顯著的城陵磯和安慶2個站位在聚類分析時不再聚為一類。由聚類分析的結果表明，DGGE技術可以有效地對長江干流的浮游植物多樣性進行研究，各站位的物種組成聚類的結果很好地反映了它們所屬站位的空間分布格局。根據2004年7—8月（雨季）和2005年5月（旱季）長江各站點的浮游植物生物量和主要營養鹽數據做聚類分析［19］，由雨季的聚類分析結果表明，所有站點可以分成2類，中下游從洪湖到江陰為一類，而涪陵到中游的監利為一類，與本研究具有較高的一致性，說明浮游植物基本上是按照其所屬環境格局進行分布；而在旱季各站點可以歸為3類，沒有較為顯著的分布特征，與本研究有一定差異。導致這種差異性的主要原因可能是：2研究所采用的方法不同，由于傳統的檢測生物量的方法與分子生物學方法具有不同的靈敏度，進而會導致實驗結果的差異；此外，研究的站位及調查取樣的時間不同，也會導致分析結果的偏差。總之，基于DGGE圖譜的聚類分析結果得到的浮游植物的區域分布，反映了各類群所屬海域的環境特征，PCR-DGG技術在該水域的浮游植物群落區域性分布研究中取得了很好的結果。

圖7 2006年4月及9月長江干流懸浮顆粒物的沿程分布Fig.7 The distribution of SPM concentrations in the Yangtze River in April and September 2006

在CCA分析結果的雙序圖中，清楚地看出各站位浮游植物對于不同生態環境的要求，并且對環境條件要求相近的站位在圖中的位置較為接近。環境因子用帶有箭頭的線段（矢量）表示，箭頭連線與排序軸的夾角表示該環境因子與排序軸相關性的大小，箭頭所指的方向表示該環境因子的變化趨勢［13］。本研究中，CCA分析結果的雙序圖表明了各環境因子對各站位的影響（見圖6A）：4月份組Ⅰ主要是受懸浮顆粒物和硅酸鹽的影響，組Ⅲ受氨氮的影響比較顯著，而組Ⅱ與本研究中所涉及到的理化因子的相關性均較小。從圖6B中可明顯看出9月份各站位與環境因子的相關性：組Ⅰ與硅酸鹽有較強的正相關，組Ⅱ主要受氨氮的影響，與之呈現較強的相關性。此外，2個月份的CCA雙序圖表明，涪陵，豐都2個站位均受懸浮顆粒物的影響較大。在本次調查期間，2個月份的浮游植物群落組成均與硅酸鹽的相關性較強。Yan等［3］運用DGGE技術對2006年4月份位于三峽庫區10個站位（香溪河及長江干流各5個）的真核浮游生物的研究，也表明了硅酸鹽這一理化因子的重要性。

浮游植物沒有或僅有微弱的運動能力，主要是隨波漂流。因此，水流對其分布有著重要影響。長江是一個處于動態的水體，水流必然在浮游植物的組成中起著重要作用。但在本研究中，由于缺乏流速的數據，未能將其納入CCA的分析當中，因而可能會導致分析結果的某些偏差。有關研究表明，長江干流浮游植物的數量及生物量與營養鹽無顯著的相關性，決定長江干流浮游植物數量及生物量的是水文條件（主要是干流的水動力因素），并且長江干流硅酸鹽的含量與水流量有著顯著的正相關［19］。因此，懸浮顆粒物、硅酸鹽與銨鹽有可能是受長江干流的水文條件的影響比較顯著，從而與浮游植物表現相似的變化規律，而并非與浮游植物的組成具有直接的因果關系。事實上，這種由于水文條件而決定浮游植物的數量及生物量的現象，在世界其它河流中也有報道［20－21］。

分子生物學方法在研究浮游生物多樣性方面具有其它方法無法比擬的靈敏性［17］，比起其它生物學方法，更適合用于細菌以及浮游生物等的分析［22］，基于18S rDNA的DGGE技術在本研究中亦取得了很好的研究結果。在本次調查期間，硅酸鹽、懸浮顆粒物和氨氮對浮游植物組成的影響較為明顯，但是由于長江徑流量的年際變動，影響浮游植物組成的理化因子也會有所不同。因此，要想獲得更加詳盡的結果，需要進一步的現場調查及探索。此外，由于不同的方法具有不同的靈敏度，基于形態學特征等的其它研究方法與本研究結果可能會存在一些差異，多種方法相互補充，會取得更加全面的分析結果。

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