白腐菌降解木質素的研究進展（綜述）

李阿敏 李國慶 常 艷 蔡永萍* 林 毅 聶 凡 陳靜嫻

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白腐菌降解木質素的研究進展（綜述）

李阿敏1李國慶2常 艷1蔡永萍1*林 毅1聶 凡2陳靜嫻2

(1.安徽農業大學生命科學學院,合肥 230036;2.安徽省農業科學院園藝研究所，合肥 230031)

白腐菌能夠分泌木質素降解酶，具有較強的降解木質素能力。利用白腐菌的木質素酶系統可以降解秸稈，提高秸稈的營養價值和利用率。通過參閱分析34種相關文獻和研究心得，從降解木質素的白腐菌種類，白腐菌降解木質素的主要時期，白腐菌降解木質素途徑、條件，以及木質素降解分子生物學等方面綜述白腐菌降解木質素的研究進展。

白腐菌；木質素降解酶；降解產物；分子生物學

秸稈富含營養物質，其主要成分為纖維素、半纖維素和木質素。其中，木質素是由聚酚化合物組成的大分子聚合物，是結構復雜、穩定、多樣的無定形三維體型大分子，其與半纖維素以共價鍵形式結合，將纖維素分子包埋在其中，形成一種天然屏障，使微生物不易與纖維素分子接觸，降低秸稈的利用率和營養價值。常用的破除木質素的方法有輻射、蒸汽爆破、膨化、研磨、酸解法、堿處理法、氧化處理法、有機溶劑法等，但這些傳統的物理、化學方法僅可脫除植物纖維原料中約50%的木質素，且帶來了高能耗、二次污染等一系列問題[1]。用生物法降解木質素不僅可以減輕環境污染，節省能耗，還可以變廢為寶，實現秸稈資源再利用。

自然界參與降解木質素的微生物種類有真菌、放線菌和細菌等，但迄今為止最有效、最主要的木質素降解微生物是白腐真菌，可徹底降解木質素使之成為CO2和H2O。白腐真菌是一類絲狀真菌，因附生在樹木或木材上，引起木質白色腐爛而得此名。分類學上，白腐真菌屬于真菌門，絕大多數為擔子菌綱，少數為子囊菌綱。本文將從分類、生理生化、分子生物學等方面綜述白腐菌降解木質素的研究進展。

1 降解木質素的白腐菌種類

降解木質素的真菌大致分為三類：白腐菌、褐腐菌和軟腐菌。根據白腐菌優先降解細胞壁成分的不同可將其分為兩類：第一類，既降解木質素，又降解纖維素和半纖維素，代表菌株為少數黃孢原毛平革菌（P.）[3]；第二類，優先降解木質素，后降解纖維素和半纖維素，代表菌株為粗毛栓菌、平菇[2,4]。本實驗室研究發現大多數糙皮側耳菌株（）如蘇平1號、皖平1號、蘇平3號、黑平A等菌株優先降解秸稈中木質素，后降解纖維素和半纖維素[2]。

在處理秸稈的微生物中，以第二類白腐菌為重要，研究它可為生物降解秸稈、提高秸稈的營養價值以及消化率奠定基礎。白腐菌可廣泛應用于木材、秸稈等木質纖維素的降解，可將稻草、麥稈等多種難以降解利用的農業廢棄物轉變為有價值的產品，用作動物飼料或其他食品[4]；還可利用白腐菌的木質素酶系統對有機污染物、生物異源物質和工業廢棄物等進行有效的降解。

2 降解木質素的主要時期

白腐菌的生長分為菌絲體和子實體兩個時期。黃慧等[5]用黃孢原毛平革菌處理玉米秸稈，發現前15天內木質素降解率不高，15天后則出現木質素含量大幅度下降。這是因為前15天主要進行菌絲體生長，該過程消耗較多營養物質，在所需營養物質不足時，木質素降解酶開始對秸稈中的木質素進行分解。分解進行到第35～40天，培養基中營養物質、水分等已基本耗盡，pH、固液比等已不適宜菌體生長，菌體對秸稈木質素的分解也達到最大限度。

李曉博[6]對雙孢蘑菇的研究結果，木質素降解最快的時期是在原基形成前，認為雙孢菇營養生長階段對木質素的養料需求較多。本實驗室研究糙皮側耳降解棉秸發現，各菌株對木質素、纖維素降解率，營養生長階段均高于子實體階段，說明菌株降解木質素主要發生在營養生長階段[2,7]。潘迎捷也發現香菇木質素降解主要在營養生長階段[8]。由上述可知，白腐菌降解木質素主要發生在原基形成前的營養生長階段。

3 降解木質素的途徑

3.1 降解途徑

白腐菌對木質素的降解主要分為兩步：先利用菌絲進行吸附，然后分泌酶對木質素分解進行催化反應。在H2O2存在的條件下，漆酶（Laccase）、錳過氧化物酶（Manganese peroxidase），以及木質素過氧化物酶（Lignin peroxidase）協同作用于連接木質素結構單元之間的酯鍵或醚鍵，使木質素分解成單個的結構單元，然后再進一步催化苯丙烯醇之間的Cα-Cβ鍵斷成兩分子的苯丙烯醇，最后苯丙烯醇鏈降解為小分子的化合物而完成木質素的降解[9]。白腐真菌降解木質素的代謝途徑[10]、漆酶的催化反應機理[11]、木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶的催化反應機理，分別如圖1、圖2和圖3、圖4所示[12]。

圖1 白腐菌降解木質素的代謝途徑

圖2 漆酶的催化循環

圖3 木質素過氧化物酶的催化反應機理

圖4 錳過氧化物酶的催化反應機理

3.2 木質素降解酶活性與結構功能

（1）木質素降解過程中酶活性的變化。白腐菌分泌的木質素降解酶活性階段性變化因種類不同而有異；也可能因栽培料成分、含量的不同導致誘導產生木質素降解酶的活性不同。此外，這些酶的活性階段性變化不同還可能與其擔負著如子實體發育等其他功能有關。潘迎捷等[13]研究發現，香菇和糙皮側耳在菌絲開始生長時就表現出較高的胞外漆酶活性，當菌絲生長到25～30天時酶活性迅速上升達到最高峰，之后又急劇下降；原基形成時，糙皮側耳胞外漆酶的活性較低，甚至降到最低點。路等學等研究發現[14]，茶薪菇的漆酶和過氧化物酶活性均隨栽培時間的延長而逐漸降低。李娟等[15]也發現金頂側耳的漆酶和過氧化物酶活性均隨栽培時間的延長而逐漸降低。Turner[16]研究發現香菇的胞外漆酶活性栽培前期較高，后期逐漸消失。周長青等[17]以白靈菇為研究材料，發現胞外漆酶在菌絲生長階段（接種至后熟結束）較低，催蕾階段大幅升高，到子實體生長階段又持續降低。

（2）木質素降解酶的結構與功能分析。檢測、分離、純化白腐菌木質素降解酶，研究其生化性質、氨基酸序列（N末端）、降解酶晶體結構，有助于揭示其功能與催化作用機制。目前關于白腐菌木質素降解酶的結構與功能的具體研究結果有：漆酶的C-尾部羧基基團與His140形成氫鍵，參與質子傳遞，影響酶活性、穩定性以及動力學特性；T1位置附近有保守三肽，三肽調節O2的運輸。錳過氧化物酶含有10個主螺旋，1個副螺旋，分布在兩個區域，各含一個Ca2+，含有5個二硫鍵，第5個二硫鍵為其特有，有2個糖基化位點，其功能與增強酶的熱穩定性有關，使蛋白C-端尾部遠離主體，利于形成Mn結合位點。木質素過氧化物酶分子量38～43 kD，單個LiP分子含有8個主螺旋，3條短的反平行折疊片，其功能為在以H2O2為輔助底物時，催化木質素分子間的β-O-4鍵。

表1 影響白腐菌降解木質素的外界條件

4 降解木質素的條件

白腐菌胞外的降解酶系催化完成木質素的降解，因此凡影響降解酶系活性的因素都將直接影響木質素的降解效果，如氧（料/液比）、培養基成分（碳源、氮源、維生素及礦物質元素等）、pH、緩沖成分、底物濃度以及培養方式等。目前外界條件對白腐菌降解木質素影響的相關研究見表1。

5 降解木質素產物分析

將木質素轉化成單體物質的方法有物理法（高溫、高壓）、酸或堿催化法，以及生物法。但總的來說，物理法效率低、研磨細化或爆破的成本高，化學法存在二次污染問題，而生物法采用微生物進行降解，可以將秸稈的木質纖維素分解為小分子的碳水化合物，高效、無污染，還可實現一定的經濟價值。

由于木質素降解不完全，其降解產物可以分為低分子木質素降解產物和高分子木質素降解產物兩大類。對于低分子降解產物的分離，主要采用溶劑抽提，首先經乙酸乙醋抽提，而后把抽提產物進行不同強度的堿性溶液分級處理。木質素低分子降解產物又可分成低分子酚類、低分子酸類和中性組分，通過對得率的計算表明，中性物質含量很少，低分子酚類和低分子酸類是木質素降解產物的主要組分。對于高分子降解產物的分離，在降解之前先用苯醇溶劑抽提，之后再用乙酸乙酯抽提除去低分子降解產物。有研究表明，木質素在降解的初期產生的高分子物質有醌式結構以及?-羧基酸。

氣相色譜是通過對比未知組分的保留時間與相同條件下標準物質的保留時間來實現對化合物的定性分析的。用該法來處理復雜樣品時很難得到理想的鑒定結果[18]。另外氣相色譜法還具有對樣品處理要求高、衍生化不徹底等缺點，所以近年來常采用液相色譜、氣-質聯儀法定量分析木質素降解產物[19]。

付時雨等[20]研究發現木質素降解過程中主要發生了氧化反應，并且木質素低分子量降解產物的主要組分是低分子酚和低分子酸。進一步的研究發現這些低分子酸主要包括紫丁香酸、香草酸、對羥基苯甲酸及其衍生物，證實木質素生物降解過程發生了側鏈Cα-C?鍵的氧化斷裂。通過計算愈創木基、紫丁香基、對羥基苯基的比例，還可證明生物降解過程中木質素的愈瘡木基與對羥苯基結構單元優先降解。

鄧勛等[4]研究糙皮側耳對稻草中木質素的降解，產物中檢測出大量含有苯環的小分子，如紫丁香基、愈創木基等，證明木質素聚合體的降解首先發生在單體的側鏈及單體間的連鍵上，出現Cα-Cβ、β-O-4等斷裂，形成了單體。在進一步的降解過程中，糙皮側耳表現出其自身特有的降解機制，取代苯環單體上的甲氧基為甲基，而后發生苯環的開裂，這與報道的白腐菌降解過程有所不同。

對比生物降解前后木質素分子結構發現，經過生物處理后的木質素α-羰基含量增加同時產生芳香羧酸結構，形成這種結構與側鏈氧化以及Cα-Cβ裂解直接相關。有研究進一步推測在側鏈氧化時，苯環也被氧化裂解。Ellwardt等[21]使用13C-NMR對木質素生物處理時發生苯環開裂的推斷提供了更為直接的證據。根據其研究結果，木質素經過生物處理后產生如下幾種化合物：α-芳香羧酸，為Cα-Cβ, 氧化裂解產物；香草醇，可能為α-芳香羧酸還原產物或包括Cα-Cβ氧化裂解在內的其他反應途徑產物；芳香乙酸或芳香乙醇，可能來自β-芳基醚結構的Cα-Cβ氧化裂解。Enoki等[22]利用白腐真菌處理帶有β-芳基醚鍵的模型化合物4-乙氧基-3-甲氧基酚丙三醇-β-愈創木基醚得到降解產物2-(鄰甲氧基酚)乙醇也證實了β-芳基醚鍵的斷裂。另外，通過芳香乙酸還原或其他途徑也可以得到芳香乙醇結構。

6 木質素降解分子生物學研究進展

6.1 白腐菌木質素降解酶基因克隆

為了深入了解食用菌分泌的各種酶參與木質素降解的機理，人們從分子生物學角度進行研究。自從Germann等在1986年利用RT-PCR技術首先從粗糙脈孢菌中克隆出漆酶基因以來[23]，迄今已經有大約30種不同來源的漆酶基因被克隆和測序，包括粗糙脈孢菌、栓菌、偏腫革裥菌、糙皮側耳漆酶等（表2）。

表2 白腐菌木質素降解酶基因克隆

6.2 白腐菌降解酶基因的表達

鑒于木質素降解酶的作用底物非常廣泛，它們在制漿造紙廢水處理、生物漂白、有毒環境污染物轉化、農業秸稈處理、染料脫色，以及能源開發等很多領域具有非常高的潛在價值，成為近年來倍受關注的環境友好型材料[29]。但是，目前限制這些酶廣泛應用的重要因素是產量低，價格昂貴。解決該問題的一個可行辦法是進行相關酶基因的克隆與表達，以期獲得高產酶菌株。同時還要進一步研究酶的分離、純化工藝，提高分離、純化的效率，從而降低酶的生產成本，使其得到更廣泛的應用。

Sun H. R. 等[30]在多孔菌中過表達漆酶，發現相較于野生型而言，過表達菌株的漆酶活力、對RBBR染料的脫色能力、木質素總重量損失率，以及木質素損失率都提高了很多。孫亞范[31]將木質素過氧化物酶在畢赤酵母中表達，以黎蘆醇為底物進行酶活測定，得到最高胞外木質素過氧化物酶活力為1997 U/L，較出發菌株（899 U/L）提高了122.1%。T. Irie等[32]將重組的錳過氧化物酶基因在糙皮側耳中同源表達，結果顯示MnP活性比野生型高好幾倍。但是基因的表達仍然會受到一定因素的影響，例如：N端加工以及糖基化作用會影響蛋白質的分泌，C端的加工則可能調控著酶的活性，C端加工位點突變或C端被截短會影響漆酶的活性[33]。漆酶的光譜學、動力學、定點突變及重組漆酶的研究表明，還原電勢的高低決定著真菌漆酶的活性高低，即還原電勢越高，漆酶活性越大。另外，由于是異源表達，不同物種密碼子的偏好性不同，同樣會影響漆酶的活性[34]。楊建強等[34]利用基因重組技術，以及定點突變技術在野生革耳漆酶C端添加了15個氨基酸殘基，得到該漆酶的一個突變體并在畢赤酵母中成功實現了高活性表達，為今后研究提高木質素降解相關酶基因的異源表達提供了新的思路和方法。

7 小 結

綜上所述，關于白腐菌降解木質素的適宜條件、木質纖維素降解及相關酶的變化規律等仍有許多值得研究的課題，如：①關于木質纖維素的變化與酶活性變化之間的關系目前還鮮有報道。②由于糙皮側耳降解木質素所得產物復雜多樣，目前只是根據產物簡單推斷降解過程可能發生的反應，而對于木質素代謝的具體途徑未見研究報道。③分子生物學方面的研究主要集中在木質素降解相關酶基因的克隆，以及同源、異源表達方面，以期解決酶產量低、價格高這一難題，而對于相關酶基因表達的調控機理與調控因素的研究則很少。

可以預見，未來關于白腐菌降解木質素的研究仍將朝著基礎研究和應用研究兩個方向發展。基礎研究方面，開發相關酶基因的高表達菌株，探索酶合成的影響因子及其在降解木質素過程中的調控方式，完善木質素的新陳代謝網絡，構建相關酶基因工程菌，利用基因敲除、誘變等方法對相關酶基因的功能以及表達調控機制進行研究。應用研究方面，本著服務人類生活以及健康、環境保護及治理等宗旨，一方面繼續研究食用菌對秸稈的降解，利用降解后的成分生產糖類、酒精、飼料等，真正做到資源的充分利用；另一方面，利用食用菌能降解多環芳香類污染物或廢棄物，降解重金屬、農藥殘留等，保護環境，同時還可獲得一定的經濟效益。

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Research progress on lignin degradation by white rot fungi

Li Amin1, Li Guoqing2, Chang Yan1, Cai Yongping*1, Lin Yi1Nie Fan2, Chen jingxian2

(1.College of life science, Anhui Agriculture University, Anhui Hefei 230036; 2.Horticulture Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences, Anhui Hefei 230031)

White rot fungi can secrete lignin-degrading enzymes, which have a strong ability to degrade lignin. Using the enzyme system of white rot fungi can degrade straw lignin, improve the nutritional value and utilization of straw. The research of lignin degradation by white rot fungi, including white rot fungi lignin-degrading enzymes, lignin degradation products, lignin degradation condition and molecular biology of lignin degradation etc.are reviewed.

White rot fungi; lignin-degrading enzymes; degradation products; molecular biology

S646

A

2095-0934（2015）02-95-07

安徽省科技計劃項目“農業廢棄物栽培食用菌關鍵技術研究與應用（1101c0603062）”；安徽省農科院院長青年創新基金項目（14B0322）；安徽省棉花、蔬菜產業技術體系（食用菌）；安徽省棉花11.5創新團隊

李阿敏（1989—）,女，安徽農業大學在讀碩士，主要從事食用菌降解木質素方面研究

*為通訊作者，E-mail：swkx12@ahau.edu.cn