富血小板血漿在燒傷治療中的應(yīng)用方法及價值評估

李 彬，張科驗

燒傷是一種特殊的創(chuàng)傷，燒傷之后不但涉及燒傷面的病理生理變化，而且還涉及機體其他組織器官的病理生理變化［1］。燒傷后燒傷面的組織遭到大量損傷，這些損傷涉及皮膚和皮下組織，包括皮下組織內(nèi)的血管損傷，導(dǎo)致組織的缺血缺氧。這些損傷不但影響著燒傷組織的修復(fù)而且嚴重者會損傷其他組織與器官，導(dǎo)致其他組織器官的免疫功能紊亂，炎癥介質(zhì)釋放，最終導(dǎo)致其他組織器官功能的衰竭［2］。富血小板血漿（plateletrich plasma，PRP）含有豐富的高濃度的各種生長因子，可以促進受損傷組織器官的修復(fù)，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)將PRP用于臨床多種損傷的修復(fù)［3－5］。為探討PRP在燒傷治療過程中的應(yīng)用方法和應(yīng)用價值，筆者進行了如下的臨床研究。

1 材料與方法

1．1 主要試劑與設(shè)備 抗凝劑：枸櫞酸鈉（四川南格爾生物醫(yī)學(xué)股份有限公司），凝血酶（山東綠葉制藥有限公司），氯化鈣（天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司），VEGF酶聯(lián)檢測試劑盒 （上海綠葉生物技術(shù)有限公司），TGF－β1酶聯(lián)檢測試劑盒 （上海綠葉生物技術(shù)有限公司），Centrifuge5417R型離心機（Eppendorf公司），iMARK 型酶標儀（Biorad 公司）。

1．2 病例來源 2013年1月—2014年1月筆者所在科收治深Ⅱ度燒傷患者66例。男40例，女26例；年齡21～67歲，平均46．3歲。將這些患者隨機平均分為兩組：PRP組，男20例，女13例，平均年齡45．6 歲，平均潰瘍面（7．5±1．4） cm2；對照組，男 20例，女 13 例，平均年齡 47．1 歲，平均潰瘍面（7．2±1．6）cm2。PRP組與對照組資料具有可比性。

1．3 PRP的制備 本實驗制備PRP采用二次離心法制備，具體操作步驟如下。根據(jù)不同燒傷患者燒傷面積的大小，分別抽取不同量的靜脈血，將抽取的靜脈血與抗凝劑枸櫞酸鈉按照10∶1的比例混入離心管中，輕微振蕩，將混勻后的離心管在離心機第一次離心，離心條件為：1500 r／min，10 min。第一次離心后將上部分的血漿和血漿與血細胞分階層1 mm處的紅細胞轉(zhuǎn)移到另一離心管中，第二次離心，離心條件為：3600 r／min，10 min。棄去上層血小板含量極少的血漿，下層即為臨床應(yīng)用所需的PRP。上述所用步驟均需在無菌環(huán)境中進行，以免所制的PRP含有病菌，造成燒傷患者的感染。

1．4 治療方法 將1．3制備的無菌的PRP和10%氯化鈣混合，10%氯化鈣含有少量的凝血酶，PRP與10%氯化鈣的混合比例為1∶9，混合均勻后即得PRP凝膠。將PRP組與解毒燒傷膏組燒傷患者的燒傷面清洗干凈，除去分泌物和膿痂，并對PRP組和對照組都采用相應(yīng)的內(nèi)科治療。對于PRP組燒傷患者，將PRP凝膠均勻涂布于燒傷處，待PRP凝膠將燒傷處全部涂布后用單層的凡士林紗布覆蓋燒傷處，最后用無菌敷料包扎，每天換藥一次，直至燒傷面愈合。對照組除了相應(yīng)的內(nèi)科治療外，僅用凡士林紗布和無菌敷料包扎，每天更換凡士林紗布和無菌敷料一次，直至燒傷面愈合。

1．5 指標觀察與檢測

1．5．1 肉芽組織的成熟度 參照相關(guān)文獻［6］在治療后的 5、10 d，用得分 0、1、2、3、4 患者數(shù)，對燒傷患者燒傷面肉芽組織進行形態(tài)學(xué)描述。

1．5．2 創(chuàng)面愈合時間 創(chuàng)面愈合時間的計算方法，將初次涂布PRP作為第一天，統(tǒng)計患者燒傷面完全愈合時所需的天數(shù)即為創(chuàng)面愈合時間。

1．5．3 患者血清中VEGF濃度 分別在燒傷患者受試的第五天和第十天抽取每個受試者的靜脈血與采血管中，靜止20 min，待管中血液分層后用低速離心機離心，離心條件為 3000 r／min，10 min。抽取上成血清，按照VEGF酶聯(lián)檢測試劑盒操作說明檢測每位受試者涂布藥物5 d和10 d后血清中的VEGF濃度。

1．5．4 患者血清中 TGF－β1 濃度 采用 1．5．3 中所分離的每位受試者第五天和第十天的血清，按照TGF－β1酶聯(lián)檢測試劑盒操作說明檢測每位受試者涂布藥物5 d和10 d后血清中VEGF的濃度。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 等級計數(shù)資料采用秩和檢驗，計量資料以 （±s）表示，采用方差分析和t檢驗，以P＜0．05為有顯著性差異。采用SPSS17．0進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié) 果

2．1 PRP對肉芽組織成熟度的影響 燒傷創(chuàng)傷面涂布PRP凝膠后與對照組相比，涂布后5 d和涂布后10 d創(chuàng)傷面的肉芽組織的成熟程度均顯著好于對照組，即P＜0．01。結(jié)果表明，PRP能促進燒傷后創(chuàng)傷面肉芽組織的成熟。見表1。

表1 PRP對肉芽組織成熟程度的影響

2．2 PRP對創(chuàng)面愈合時間的影響 在燒傷創(chuàng)傷處涂布PRP凝膠后，創(chuàng)傷面愈合時間顯著減少，PRP組與對照組比較，創(chuàng)面愈合時間有顯著性差異，即P＜0．01。結(jié)果表明，PRP能促進燒傷后創(chuàng)傷面愈合。見表2。

表2 PRP對創(chuàng)面愈合時間的影響

2．3 PRP對患者血清中VEGF的影響 PRP組與對照組比較，PRP組5 d后及10 d后血清中VEGF的濃度均有顯著性差異（P＜0．01）。結(jié)果表明，PRP 可以促進燒傷患者血清中VEGF濃度的升高。見表3。

表3 PRP對患者不同時間點血清中VEGF濃度的影響

2．4 PRP對患者血清中 TGF－β1的影響 PRP組與對照組比較，PRP組5 d后及10 d后血清中TGF－1 的濃度均有顯著性差異（P＜0．01）。結(jié)果表明PRP可以促進燒傷患者血清中TGF－1濃度的升高。見表4。

表4 PRP對患者不同時間點血清中TGF－1濃度的影響

3 討 論

機體燒傷后，機體的組織生理結(jié)構(gòu)遭到破壞，如組織內(nèi)的血管受損，造成受損傷組織缺血缺氧，導(dǎo)致機體燒傷后組織難以得到新生修復(fù)。研究表明，血管的新生，組織的修復(fù)是在機體內(nèi)生長因子的作用下進行的。微環(huán)境中多種生長因子濃度的升高可顯著地促進血管新生和組織修復(fù)；當微環(huán)境中各種生長因子缺少時，可導(dǎo)致組織修復(fù)細胞的凋亡和新生血管的退化［7－9］。

PRP是人或動物的全血經(jīng)過單次或多次低速離心后獲得的血小板濃度較高的血漿，PRP與含有凝血酶的氯化鈣混勻后，可以制成臨床常用的易于涂布于創(chuàng)面處的PRP凝膠。PRP富含有豐富的血小板，而在機體中血小板可以合成多種生成因子，促進組織的生長發(fā)育，損傷組織的修復(fù)，如PRP中含有豐富的血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子等［10］。大量的研究表明，單一的生長因子不能有效地促進細胞的增生，不能促進血管的新生，進而不能促進受損傷組織的修復(fù)，而只有當多種生長因子共同作用時才能促進細胞的增生，血管的新生，組織的修復(fù)［11］。而PRP所含有多種豐富的生長因子正符合了這一生理特點。故在本實驗中涂布了PRP凝膠的燒傷創(chuàng)面肉芽組織的成熟度明顯大于未涂布PRP凝膠的對照組，這一結(jié)果在涂布PRP凝膠5 d和10 d時作用同樣明顯；另外本實驗結(jié)果同樣也表明PRP可以縮短燒傷創(chuàng)面的完全愈合所需要的時間，PRP通過所含有的豐富多種的生長因子對燒傷的治療起著非常顯著的作用。

機體燒傷后的修復(fù)過程與血管的新生是密不可分的，血管的新生可以使新的血液運輸?shù)绞軗p傷部位，一方面為受損的部位提供充足的氧氣，供組織細胞的有氧呼吸；另一方面可以為受損傷組織提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。VEGF是目前已知的最強的血管滲透劑，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移，并且可以促進毛細血管管腔的形成，最終使新生血管的數(shù)目在受損傷組織中增加。目前VEGF的治療已廣泛地應(yīng)用于肌肉、骨骼、神經(jīng)、肌腱、燒傷等創(chuàng)傷的修復(fù)。如 Lyras等［12］證實在兔跟腱損傷模型中給予PRP治療術(shù)后2周新生血管密度顯著增高，第2周達到最高值，并在第3、4周出現(xiàn)明顯下降。Yin DK等［13］研究表明VEGF可以顯著促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增生。本實驗中，當燒傷處涂布PRP凝膠后，不但促進燒傷處的愈合，而且升高了血清中VEGF的濃度，結(jié)合上述討論表明，PRP通過促進血管的生成，增加燒傷處的供血，最終促進燒傷創(chuàng)面的愈合。

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF－β）是一種具有多種作用功能的活性蛋白質(zhì)，可以促進細胞增殖和細胞的分化，可以增加細胞外基質(zhì)的分泌，參與機體多種生長發(fā)育和組織修復(fù)過程，如胚胎的發(fā)育、血管的形成、骨的重建、創(chuàng)傷的愈合等［14］，TGF－β 主要有三種亞型，近年來多個實驗表明，TGF－β1對血管的形成、創(chuàng)面的修復(fù)起著重要的作用。TGF－β1是通過促進創(chuàng)面處修復(fù)細胞DNA的合成，促進創(chuàng)面處肉芽組織的形成與成熟，最終促進創(chuàng)面?zhèn)诘挠稀Ｈ鏚ashiwagi等［15］證實在大鼠跟腱局部予 TGF－β1 治療后，可以提高Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維mRNA的表達，同時可以提高跟腱的最大斷裂力和剛度。本實驗中當燒傷處涂布PRP凝膠后，在促進燒傷處愈合的同時血清中TGF－β1濃度也升高，同上述討論PRP通過自身所含有的豐富的生長因子來加速燒傷創(chuàng)面處的愈合。

通過上述可見PRP在治療燒傷時具有很高的臨床應(yīng)用價值。①PRP是通過患者自身的靜脈血液經(jīng)過簡單的步驟制的，具有操作簡單，價格便宜，安全可靠。②在臨床使用時只是將所提取的PRP與含有少量凝血酶的氯化鈣混合制成凝膠，再涂布于切口處，具有使用方便，患者用藥順應(yīng)性高的優(yōu)點。③PRP中具有多種生長因子，各種生長因子從不同方面促進創(chuàng)面處的愈合，如VEGF促進血管的新生，TGF－β1促進修復(fù)細胞DNA的合成等；PRP促進創(chuàng)面的愈合療效顯著，可以顯著的促進肉芽組織的成熟，縮短切口痊愈的時間。由此可見PRP在治療燒傷時具有很高的臨床應(yīng)用價值，值得推廣使用。

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