腹腔內(nèi)注射脂多糖對大鼠黑質(zhì)ROS含量及NADPH酶的影響

白麗娟 姜 新 陳曉虹 任 艷 羅曉光

(1.遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽110016;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽110001)

小膠質(zhì)細胞被激活后能夠產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，產(chǎn)生細胞毒性作用，稱為氧化應(yīng)激反應(yīng)。大量研究［1-3］表明，氧化應(yīng)激在帕金森病的發(fā)病機制中起重要作用，而抗炎物質(zhì)能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有神經(jīng)保護作用。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)酶廣泛表達于中胚層來源的細胞中，如小膠質(zhì)細胞、粒細胞和血管細胞。在外界刺激下，NADPH氧化酶激活，將電子從 NADPH傳遞給氧分子，從而產(chǎn)生ROS。本研究以SD大鼠為研究對象，觀察了經(jīng)腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)后，大鼠黑質(zhì)NADPH氧化酶的表達及ROS的產(chǎn)生情況。旨在探討小膠質(zhì)細胞被激活后的氧化應(yīng)激機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

取健康SD雄性大鼠，共200只，中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗部門提供，實驗動物許可證號:SCXK(遼)2013-0001。分別將大鼠分為實驗青年組、老年組，對照青年組、老年組4組，各組大鼠均為50只;其中，青年組為雄性兩月齡大鼠(體質(zhì)量250～350 g)，老年組為雄性12月齡(體質(zhì)量450～600 g)。

各組又根據(jù)不同時間點隨機分為5個亞組，每個亞組分別為10只SD大鼠，分別于給藥后6 h、12 h、24 h、48 h及1周時處死。各組中有25只檢測ROS產(chǎn)生情況，另外25只檢測NADPH酶在胞質(zhì)蛋白和膜蛋白的表達情況。

1.2 方法

實驗組均給予腹腔注射LPS 1 mg/kg，對照組均給予腹腔注射0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液1 mg/kg，各組大鼠分別于給藥后 6 h、12 h、24 h、48 h 及 1周時快速斷頭取腦黑質(zhì)。DCFH-DA探針檢測各組大鼠ROS產(chǎn)生情況。采用Western blotting法檢測各組大鼠NADPH酶情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行析因方差分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 各組大鼠活性氧(ROS)產(chǎn)生情況

老年組與青年組相比，各時間點老年組ROS含量相對較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);對照老年組各個時間點與對照老年組6 h相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);對照青年組各個時間點與對照青年組6 h相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。但實驗老年組、實驗青年組各個時間點與各自實驗老年組、實驗青年組6 h相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，ROS在12 h達到最高，之后并逐漸下降;實驗組均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1，圖1)。

表1 各組大鼠ROS的量Tab.1 ROS content of the rats in each group n=5

圖1 各組ROS的量Fig.1 ROS content in each group

2.2 檢測各組大鼠NADPH酶表達情況

2.2.1 各組大鼠胞質(zhì)中NADPH酶表達情況

實驗老年組及實驗青年組在腹腔注射LPS 12 h均可見胞質(zhì)中NADPH酶表達增多，達高峰，之后隨時間延長而減少;而對照組胞質(zhì)中NADPH酶表達量隨時間延長無明顯變化(圖2)。

2.2.2 各組大鼠胞膜上NADPH酶表達情況

實驗老年組及實驗青年組在腹腔注射LPS 12 h均可見胞膜上有NADPH少量表達，而對照組未見胞膜上有NADPH酶的表達(圖3)。

圖2 各組胞質(zhì)中NADPH酶表達情況Fig.2 Expression of NADPH oxidase in cytoplesm

3 討論

機體內(nèi)產(chǎn)生活性氧的途徑很多，其中包括線粒體呼吸鏈和促氧化酶類。已知激活的小膠質(zhì)細胞能生成大量的活性自由基(包括活性氧、活性氮)，參與氧化應(yīng)激反應(yīng)［4］。NADPH氧化酶是小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生ROS的主要介質(zhì)，其活性變化對局部組織器官乃至全身活性氧水平的高低具有重要影響。已有研究發(fā)現(xiàn)在LPS刺激小膠質(zhì)細胞活化后，它通過激活NADPH氧化酶產(chǎn)生大量ROS。

NADPH酶廣泛表達于中胚層來源的細胞系中，如小膠質(zhì)細胞、粒細胞和血管細胞。它由多個亞基組成，包括位于胞膜的b558(gp91phox和p22phox)和胞質(zhì)亞單位 p47phox、p67phox、p40phox和 GTPase。在外界的刺激下，其胞質(zhì)中的亞基(主要是p47phox)轉(zhuǎn)運到細胞膜上，與位于膜上的亞單位 b558結(jié)合，NADPH氧化酶激活，催化電子從NADPH傳遞到氧分子，同時產(chǎn)生 ROS［5］。

圖3 各組胞膜上NADPH酶表達情況Fig.3 Expression of NADPH oxidase in membrane

中腦黑質(zhì)是腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞密度最高的區(qū)域，同時在DA合成過程中會產(chǎn)生大量的對神經(jīng)元有毒性的易受氧化的DA代謝物，加之多巴胺能神經(jīng)元的抗氧化能力低，因此，黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元對氧化應(yīng)激尤為敏感［6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，激活的小膠質(zhì)細胞中NADPH酶產(chǎn)生的氧化自由基可能是導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性壞死的“重犯”。已有研究［8］提出PHOX-ROS通路參與了LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。胞質(zhì)亞單位p47phox是NADPH氧化酶最重要的調(diào)節(jié)亞基，它在NADPH酶釋放過氧化物粒子中起關(guān)鍵作用［9-12］，p47phox在胞膜上的表達水平是提示PHOX活性的重要指征［13-14］。

本實驗中，腹腔注射LPS 12 h，大鼠黑質(zhì)內(nèi)ROS活性達到高峰，但老年組與青年組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示LPS刺激后(12 h)無論在老年組與青年組均有小膠質(zhì)細胞活化，即發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。并且，腹腔注射LPS 12 h，老年組及青年組NADPH酶表達均增加，達到高峰，此后逐漸下降，但兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而在12 h之后亦可見老年組及青年組NADPH酶由胞質(zhì)向細胞膜移位，這提示LPS刺激后(12 h)，無論在老年組與青年組氧化應(yīng)激反應(yīng)均可能是通過激活NADPH氧化酶途徑而發(fā)生的。

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