尖銳濕疣患者的細胞免疫功能及其與陰莖包皮組織中HPV DNA水平的相關分析

王一鳴，程燕，樹瑜

(成都市第二人民醫院，成都610017)

尖銳濕疣(CA)系人乳頭瘤病毒(HPV)感染所致的一種常見和易復發的性傳播疾病，其發生、復發及轉歸可能與HPV載量及機體的免疫狀況有關。細胞免疫功能異常可能是造成病毒持續感染的主要原因之一，尤其是T淋巴細胞數量和功能的異常。本文對CA患者病毒載量及外周血T淋巴細胞亞群(CD+3、CD+4、CD+8)進行檢測，并對細胞免疫與病毒載量之間相互關系進行了分析，旨在為CA發病機制及其治療提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1～12月本院皮膚性病科門診就診的CA患者81例(CA組)，均符合衛生部疾病控制司制定的CA診斷標準。男49例、女32例，年齡20～70歲。初發患者41例，復發患者40例。30例正常對照來自本院包皮環切術的健康男性(對照組)，近期無局部感染和CA史。排除免疫功能低下或長期服用免疫抑制劑、糖尿病、不能定期隨訪者。

1.2 CA患者外周血CD+3、CD+4、CD+8T細胞百分比的檢測 治療前后1個月取外周血2 mL，加入到EDTA抗凝管中，混勻。取流式細胞儀上樣管，每管中加入外周血100 μL(經EDTA抗凝處理)混勻，然后分別加入 20 μL CD3-FITC、CD4-FITC/CD8-PE 抗體，充分混勻，室溫避光孵育30 min，隔10 min手工輕搖1次，以便熒光標記抗體與樣品充分反應，然后加入紅細胞裂解液500 μL充分混勻，避光孵育10 min，PBS 洗細胞 1 次(2 000 r/min，5 min)，棄去上清液，每管加500 μL鞘液，充分混勻，上機檢測。

1.3 CA組織中HPV6/11 DNA水平的檢測 采用PCR法。暴露疣體，常規消毒，用血管鉗摘取部分疣體組織，部分標本置入備有1 mL生理鹽水的無菌樣本管中，標本存于-20℃冰箱待檢。部分標本經10%中性甲醛室溫固定、石蠟包埋、室溫存放、實驗時將標本制成4 μm厚的石蠟切片。DNA提取:取出待測樣本(組織需剪碎)，置于室溫下解凍，振蕩混勻后取100 μL于另一無菌的0.5 mL離心管內，13 000 r/min離心10 min，小心吸棄上清液，保留沉淀物，再向沉淀物內加入DNA提取液50 μL，振蕩混勻，100℃沸水浴10 min，13 000 r/min離心10 min，保留上清液待用。DNA抽提和PCR擴增:HPV陽性標準品的稀釋和標本處理按試劑盒說明書操作。取PCR反應管1支，加入處理后的標本或陽性標準品2 μL，8 000 r/min離心數秒，將各反應管放入PCR儀的反應槽內，按對應順序設置陰性對照、陽性標準品梯度及未知標本采用熱啟動法擴增。擴增條件:93℃預變性2 min，93℃ 45 s，55℃ 60 s，10個循環;93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個循環。計算機分析，確定基線和閾值，建立標準曲線，讀取并計算各管DNA含量。

1.4 治療方法 對所有CA患者的疣體均采用CO2激光去除，待傷口愈合后外用干擾素凝膠，每周復查1次，術后隨訪3個月。肉眼疣體消失，無新發疣體出現為治愈，在原皮損處或鄰近部位有新疣體出現者為復發。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，比較采用成組t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組HPV6/11 DNA比較 在81例CA中，檢出HPV6/11型陽性者77例(95.06%)。CA初發及復發者陰莖包皮組織中HPV6/11 DNA分別為(2.31×103～3.72 ×104)copies/mL 和(4.63 ×104～1.7×106)copies/mL，復發組高于初發組(t=-28.541，P ＜0.01)。HPV6/11 型高載量組(復發患者)30例(38.96%)，低載量組(初發患者)47例(61.04%)。

2.2 兩組外周血T細胞亞群比較 見表1。

表1 兩組外周血T細胞亞群比較(±s)

表1 兩組外周血T細胞亞群比較(±s)

組別 n CD+3(%) CD+4(%) CD+8(%) CD+4/CD+8 CA 組 81 62.83 ±9.11 31.74 ±8.53 30.67 ±8.39 1.19 ±0.73對照組 30 71.54 ±8.42 42.39 ±8.38 25.26 ±8.32 1.69 ±0.79 t 4.86 5.32 6.04 3.25 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 高載量與低載量組CA患者外周血T細胞亞群比較 見表2。

表2 高載量與低載量組CA患者外周血T細胞亞群比較( ± s)

表2 高載量與低載量組CA患者外周血T細胞亞群比較( ± s)

組別 n CD+3(%) CD+4(%) CD+8(%) CD+4/CD+8高載量組 30 62.32 ±8.52 29.73 ±6.87 32.76 ±8.46 0.89 ±0.65低載量組 47 62.89 ±9.12 32.97 ±5.64 29.84 ±7.31 1.13 ±0.72 t 1.32 4.87 4.39 3.96 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

HPV是一種DNA病毒，屬乳多空病毒科，是最小的DNA病毒，也是一種致瘤病毒，皮膚和黏膜上皮細胞是它的宿主細胞，具有感染及嗜鱗狀上皮的特性。病毒感染各種鱗狀上皮細胞后，具有促上皮增長、促瘤形成的特性［1］，可引起上皮腫瘤或疣，是CA最重要的致病原因。HPV有100多種亞型，其中侵犯泌尿生殖系統的有20個型以上。CA與HPV6、11、16、18、31、33 型感染有關，其中 90%以上為HPV6/11亞型感染，少數為 HPV16/18亞型［2］。根據它們在生殖系統腫瘤形成中所發揮的不同作用，將HPV分為高危組(HPV16/18型等)和低危組(HPV6/11型)，高危組的病毒DNA通常整合到宿主基因中，其作用可能為啟動癌基因［3］。而低危組的HPV病毒常誘發良性濕疣或宮頸損傷，通常不整合到宿主基因中。CA是由HPV感染引起的，但與CA患者接觸后是否發病以及是否復發，在很大程度上取決于接觸者感染的病毒量及特異性免疫力，高載量的HPV對局部細胞免疫抑制作用相對加強，使機體難以有效清除病毒。Che等［4］研究認為，復發性CA的HPV DNA明顯高于初發性CA，HPV DNA的載量隨著復發次數以及病程的增加而升高，二者呈正相關，故認為病毒載量在CA的發病及復發中起著一定作用。De Marco等［5］研究了40例肛門生殖器CA患者，結果也表明HPV載量高的CA患者病程明顯長于載量低者。但也有學者發現HPV DNA含量與其復發無明顯關系［6］。本研究81例標本中，HPV6/11型陽性檢出率95.06%，與國內外報道接近。復發組與初發組相比，兩組DNA載量差異有統計學意義，說明病毒載量在CA的復發中起著一定的作用。

T細胞是細胞免疫的主要效應細胞，T細胞參與的細胞免疫應答是機體控制感染的關鍵［7］，它與NK細胞、巨噬細胞等一起構成了抗病毒免疫的主體，其表面的CD分子是T細胞發揮生物學功能的分子基礎，CA的發生、消退、復發及癌變與機體的免疫功能密切相關，Th1/Th2細胞因子優勢的互換，對CA的轉歸起著決定性作用。HPV感染后，機體存在特異性細胞免疫受抑制現象，不能建立有效的免疫反應，是HPV持續感染的主要原因。Morelli等發現，感染HPV的生殖器皮損處主要有CD4+和CD8+T細胞浸潤，且CD4+/CD8+下降，而在消退的皮損中，T細胞數量增加，主要為CD4+T細胞，CD4+/CD8+高于未消退的皮損，表明疣體消退時宿主細胞免疫功能恢復或增強。Kawana等也在HPV6 DNA陽性的妊娠期CA患者母體、臍血和嬰兒血清中均檢測到了抗HPV6抗體，故認為局部HPV感染導致局部的細胞免疫狀態改變，全身血液中感染有HPV，同樣也能引起全身細胞免疫狀態的改變。本研究通過檢測CA患者與正常人的外周血T淋巴細胞亞群，發現CA患者與正常人相比，外周血中CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD4+T細胞/CD8+T細胞均低，而CD8+T細胞升高，與文獻報道結果基本一致，提示CA患者細胞免疫功能受到抑制。

CA復發率較高，常難徹底治愈。研究發現，CA復發與T淋巴細胞、NK細胞免疫抑制相關聯，與病毒載量也有相關性。本研究發現，高載量組患者CD4+T淋巴細胞、CD4+/CD8+較低載量組均降低，而CD8+T細胞升高，表明高載量組細胞免疫功能低于低載量組，進一步說明CA復發與患者T淋巴細胞亞群比例有關。

總之，CA患者復發者的病毒載量高于初發者，細胞免疫功能較正常人下降，且病毒載量高的CA患者細胞免疫功能低于病毒載量低者，為CA術后加用免疫調節劑治療、預防CA復發提供了理論依據。

［1］Fennerty MB.Helicobacter pylori:why it still matters in 2005［J］.Cleve Clin J Med，2005，72(Suppl 2):S1-S7.

［2］Stanley M.HPV vaccines:are they the answer［J］.Br Med Bull，2008，88(1):59-74.

［3］ Stanley M.The epidemiology and burden of HPV disease［J］.Nurs Times，2008，104(36):38-40.

［4］Che YM，Wang JB，Liu YH.Correlation between deoxyribonucleic acid loads of human papillomavirus and recurrence of condylomata acuminata［J］.Int J STD AIDS，2005，16(9):605-607.

［5］De Marco F，Di CA，Poggiali F，et al.Detection of HPV in genital condylomata:correlation between viral load and clinical outcome［J］.J Exp Clin Cancer Res，2001，20(3):377-383.

［6］吳文中，劉姝莉，李延武，等.尖銳濕疣患者熒光定量PCR檢測結果分析［J］.中國艾滋病性病，2006，12(4):350-351，360.

［7］Kim KH，Greenfield W，Shotts E，et al.Detection of human papillomavirus type 16-specific T lymphocytes by a recombinant vaccinia virus-based enzyme-linked immunospot assay［J］.Clin Vaccine Immunol，2007，14(4):362-368.