金屬硫蛋白2A重組質粒的構建及其在血管內皮細胞中的表達＊

楊 汀，劉海榮，李家麗，劉月明

成都醫學院第一附屬醫院 燒傷整形科（成都 610000）

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一種存在于細胞中的低分子量、具有金屬結合特性的蛋白質［1］。在哺乳動物體內存在4種亞型，包括 MT－1、MT－2、MT－3和 MT－4［2］，具有調節金屬離子代謝、清除自由基、抗氧化、抗細胞凋亡以及穩定細胞質膜和亞細胞器被膜等功能，參與DNA復制、轉錄，影響蛋白質和能量代謝等［3－6］。Espejo等［7］發現 MT基因敲除小鼠對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的炎癥反應比對應的野生型小鼠更敏感，提示MT在LPS引起的炎癥損傷中可能發揮保護作用，但具體機制目前尚不清楚。MT－2是MT家族中重要的組成成分，分為MT2A和MT2B兩種亞型，參與細胞增殖、分化和凋亡等過程，并與炎癥、癌癥以及呼吸系統和神經系統疾病密切相關［8－10］。我們前期研究發現，MT2A與內皮高表達脂多糖相關因子1 基 因（endothelial－overexpressed lipopolysaccharide－associated factor 1，EOLA1）存在相互作用，并與LPS損傷人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）過程有關［11］。本研究構建 MT2A強制表達載體，并成功轉染HUVECs，建立MT2A上調表達細胞模型，為進一步研究MT2A在內皮細胞炎癥損傷中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVECs（美國 ATCC公司）；細胞培養基DMEM（GIBCO 公司）；pEGFP－N1質粒由成都醫學院生物醫學系實驗中心提供；XhoI、KpnI酶切酶（Themor公司）；cDNA模板（上海英駿生物技術有限公司）；連接酶（Themor公司）；質粒提取試劑盒及PCR產物回收試劑盒（OMEGA公司）；高純總RNA快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）；Revert AidFirst Strand cDNA Synthesis kit（Thermo公司）；Lipofectamine脂質體（Invitrogen公司）；兔抗人（一抗）（Abcam公司）；羊抗兔（二抗）（Invetrogen公 司）；凝 膠 成 像 系 統（BIO－RED 美國）；熒光倒置顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 pEGFP－N1－MT2A載體構建 根據 MT2A ORF序列采用Primer 5.0軟件設計引物。MT2AF：CCTCGAGGATGGATCCCAAC，其 5＇端包含XhoI酶切位點；MT2A－R：GGGTACCCGGCGCA GCAG，其5＇端包含KpnI酶切位點，由上海英駿生物技術有限公司合成。用所設計引物擴增MT2A ORF序列，反應體系共50μL，其中 MT2A－F和MT2A－R各1μL、cDNA模板1μL、master mix 25 μL，加水至50μL。反應條件：94℃3min，94℃10 s，49℃30s，72℃15s循環35次，72℃5min。將PCR產物進行凝膠電泳，用PCR純化試劑盒將擴增成功的PCR產物的擴增片段全部回收純化。PCR產物和pEGFP－N1載體進行雙酶切，酶切產物瓊脂糖電泳后回收純化，連接酶連接，連接條件：22℃30min，65℃10min。將連接產物轉化至DH5α中并培養，37℃過夜，挑取單克隆菌落培養并抽提質粒。對質粒進行酶切和測序鑒定。

1.2.2 pEGFP－N1－MT2A 質粒轉染及觀察 鋪6孔板，每孔約2×106個細胞，待細胞生長到培養板80%時進行轉染；取2.5μg pEGFP－N1－MT2A 加入1.5mL EP管中，加入100μL MEM1無血清培養基，此為1號管；另取1.5mL EP管加入100μL MEM1無血清培養基，緩慢加入6μL Lipofectamine脂質體，輕輕混勻，此為2號管；將1號管混合物緩慢加入2號管中，室溫靜置20min；用無血清培養基洗HUVECs兩次，加入1mL MEM1無血清，將兩管混合液緩慢加入六孔板中，37℃培養4～5h，后補加20%胎牛血清培養液1 mL繼續培養48h；將轉染細胞放置于激發波長為488nm的熒光倒置顯微鏡下觀測EGFP在HUVECs中的分布情況。

1.2.3 RT－PCR 檢測 MT2AmRNA 表達水平設立pEGFP－N1－MT2A轉染組、pEGFP－N1轉染組和空白對照組。收集各組細胞，在無RNA酶條件下提取總RNA并反轉錄成cDNA。據MT2A基因設計引物，MT2A－F：CACCACGCCTCCTCCAAG；MT2A－R：CGCAGGAGCAGTTGGGATC。反 應體系共50μL，其中SYBR Green 25μL、MT2A－F 1 μL、MT2A－R 1μL、cDNA 2μL、去核酸水21μL。反應條件：95℃10min，95℃15s，62℃20s循環40次。根據CT值，計算各組MT2A含量。實驗重復3次。

1.2.4 Western blot檢測 MT2A表達 設立pEGFP－N1－MT2A轉染組、pEGFP－N1轉染組和空白對照組。收集各組細胞，預冷PBS洗3次，吸盡殘留液，加入適量體積的細胞裂解液，冰上裂解1 h，13 000rpm 4℃ 離心30min，收集上清轉移至EP管中，即為細胞總蛋白。BCA法進行蛋白濃度測定：調整樣品濃度，以每孔80μg蛋白加樣，加入等量體積4×SDS上樣緩沖液，煮沸10min，SDSPAGE膠電泳，電泳分離后的蛋白電轉至0.22μm PVDF膜上，用脫脂牛奶封閉，加一抗4℃孵育過夜，TBST洗6次，每次5min，加二抗37℃孵育1 h，TBST洗5次，每次10min，用ECL發光法測定蛋白表達情況。實驗重復3次。

2 結果

2.1 MT2A的ORF擴增

PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，發現在略小于200bp處（目的蛋白大小為186bp）有一清晰條帶，說明MT2A的ORF擴增成功（圖1）。

圖1 MT2A的ORF擴增（M：DNA Mark；1：MT2A基因ORF）

2.2 重組質粒的酶切與測序鑒定

pEGFP－N1－MT2A重組載體經過XhoI和Kpn I雙酶切后，電泳可見大小為4 700bp、186bp的DNA條帶，與理論值一致，初步驗證pEGFP－N1－MT2A構建成功（圖2）。經酶切驗證的重組質粒送上海英駿生物技術有限公司測序，測序結果顯示：重組質粒中MT2AORF序列與Genebank中的序列一致（圖3）。

圖2 重組質粒pEGFP－N1－MT2A的酶切分析（M：DL5000mark；1：重組質粒pEGFP－N1－MT2AORF）

圖3 MT2A基因測序結果

2.3 pEGFP－N1－MT2A在HUVECs中的轉染情況

轉染48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞，可見綠色熒光表達，72h到達高峰，細胞計數計算轉染效率約為70%（圖4）。

圖4 pEGFP－N1－MT2A轉染HUVECs細胞

2.4 MT2AmRNA表達水平

pEGFP－N1－MT2A轉染組、pEGFP－N1轉染組和空白對照組3組細胞RT－PCR檢測顯示：pEGFP－N1－MT2A轉染組條帶明顯高于pEGFPN1轉染組和空白對照組（圖5）。經熒光定量PCR儀附帶軟件分析，pEGFP－N1－MT2A 轉染組2－△△Ct值為1.267±0.064，方差分析結果顯示其2－△△Ct值明顯高于pEGFP－N1轉染組和空白對照組（P＜0.05）（表1）。

圖5 MT2AmRNA表達水平

表1 3組細胞MT2AmRNA表達水平

2.5 MT2A蛋白表達情況

pEGFP－N1－MT2A轉染組、pEGFP－N1轉染組和空白對照組3組細胞Western blot檢測顯示：pEGFP－N1－MT2A轉染組條帶明顯高于pEGFPN1轉染組和空白對照組（圖6），經Qualityone圖像處理軟件定量分析，pEGFP－N1－MT2A轉染組灰度值為（1.728±0.064），方差分析結果顯示，其灰度值明顯高于pEGFP－N1轉染組和空白對照組（P＜0.05）（表2）。

圖6 MT2A蛋白表達水平

表2 3組細胞的灰度值

3 討論

嚴重燒創傷患者由于外源性細菌感染或腸源性細菌和內毒素移位，易誘發膿毒癥（sepsis），引起全身性炎癥反應綜合癥（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），臨床上預防和治療十分棘手，目前為止仍是大面積燒傷、嚴重創傷最主要的死亡原因［12］。目前已證實LPS是膿毒癥的主要啟動子，LPS激活內皮細胞是一復雜的病理生理過程，包括特異受體的感知、刺激信號的內傳、胞內信號的轉導以及相關基因的表達和細胞表型的改變。由于LPS在炎癥反應發生發展過程中起主導作用，近幾十年來有大量研究試圖通過加入外源性物質對抗LPS，從而控制炎癥反應，研究方向主要集中在中和、拮抗和競爭性抑制LPS，但在治療膿毒癥方面未取得令人滿意的效果［13］。因此，研究機體對LPS刺激產生的內源性保護反應及其機制顯得越發重要。

MT是機體重要的自我保護性蛋白，其中MT2A在清除氧自由基、抑制炎癥反應等方面有重要作用，我們前期研究結果也證實MT2A可減輕內皮 細 胞 LPS 損 傷［11］。Eckschlager 等［14］指 出MT2A的過度表達是多種腫瘤對放療、化療產生耐藥性的重要原因，這反映了MT2A在抵抗細胞損傷方面的強大作用。為進一步研究MT2A在內皮細胞炎癥反應中的作用，必須建立可調控MT2A表達的細胞模型。本實驗通過擴增MT2A的ORF片段，構建重組表達質粒pEGFP－N1－MT2A，重組質粒通過測序驗證。將重組質粒轉染至HUVECs中，熒光顯微鏡下觀察轉染細胞呈綠色，證實轉染成功。用 RT－PCR 和 Western blot實 驗 檢 測HUVECs中MT2AmRNA和MT2A蛋白的表達水平，結果顯示，pEGFP－N1－MT2A組高于空白對照組及pEGFP－N1組，證明可通過重組質粒轉染的方式成功構建MT2A上調表達細胞模型。本研究為進一步探索MT2A在炎癥中的作用機制奠定了基礎。

［1］Freisinger E，Va?ák M.Cadmium in metallothioneins［J］.Met Ions Life Sci，2013，11：339－371.

［2］Kayaalti Z，Aliyev V，Soylemezoglu T.The potential effect of metallothionein 2A－5A／G single nucleotide polymorphism on blood cadmium，lead，zinc and copper levels［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2011，256（1）：1－7.

［3］Vasak M.Advances in metallothionein structure and functions［J］.J Trace Elem Med Biol，2005，19（1）：13－17.

［4］Penkowa M. Metallothioneins are multipurpose neuroprotectants during brain pathology［J］.FEBS J，2006，273（9）：1857－1870.

［5］Mehus AA，Muhonen WW，Garrett SH，etal.Quantitation of human metallothionein isoforms：a family of small，highly conserved，cysteine－rich proteins［J］.Mol Cell Proteomics，2014，13（4）：1020－1033.

［6］Vasak M，Meloni G.Chemistry and biology of mammalian metallothioneins［J］.J Biol Inorg Chem，2011，16（7）：1067－1078.

［7］Espejo C，Penkowa M，Demestre M，etal.Time－course expression of CNS inflammatory，neurodegenerative tissue repair markers and metallothioneins during experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Neuroscience，2005，132（4）：1135－1149.

［8］Sutherland DE，Stillman MJ.The"magic numbers"of metallothionein［J］.Metallomics，2011，3（5）：444－463.

［9］Swindell WR.Metallothionein and the biology of aging［J］.Ageing Res Rev，2011，10（1）：132－145.

［10］Thirumoorthy N，Manisenthil Kumar KT，Shyam Sundar A，etal. Metallothionein：an overview ［J］. World J Gastroenterol，2007，13（7）：993－996.

［11］Liu Y，Liu H，Chen W，etal.EOLA1protects lipopolysaccharide induced IL－6production and apoptosis by regulation of MT2Ain human umbilical vein endothelial cells［J］.Mol Cell Biochem，2014，395（1－2）：45－51.

［12］Moore EC，Padiglione AA，Wasiak J，etal.Candida in burns：risk factors and outcomes［J］.J Burn Care Res，2010，31（2）：257－263.

［13］Nahra R，Dellinger RP.Targeting the lipopolysaccharides：still a matter of debate？［J］.Curr Opin Anaesthesiol，2008，21（2）：98－104.

［14］Eckschlager T，Adam V，Hrabeta J，etal.Metallothioneins and cancer［J］.Curr Protein Pept Sci，2009，10（4）：360－375.