象皮生肌膏對(duì)2型糖尿病大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β及纖維結(jié)合蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

張?jiān)戮?，李木清，?梨，王小亮

糖尿病主要以血糖增高為主要臨床表現(xiàn)，病人往往伴有多尿、多飲、多食、消瘦等臨床癥狀。由于糖尿病病人伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥，如糖尿病足部潰瘍，其發(fā)病率約為15%，而其中截肢者高達(dá)33%，因糖尿病足死亡率為29%［1］。故如何有效治療糖尿病足潰瘍顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)2型糖尿病大鼠潰瘍采用象皮生肌膏治療，觀察新生肉芽組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β（TGF－β）、纖維結(jié)合蛋白（FN）分子生物的表達(dá)及創(chuàng)面愈合率的變化。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD成年健康清潔級(jí)大鼠，雄性，體重（260．56±19．34）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK湘2011—0003。

1．1．2 試劑 大鼠TGF－β及FN的ELISA檢測(cè)試劑盒來自北京杰輝博高生物科技有限公司。

1．1．3 一般材料 10%水合氯醛（上海盛利泰化有限公司），生理鹽水，水膠體敷料［康樂保（中國(guó)）有限公司康惠爾潰瘍貼，批號(hào)：2640124］，青霉素（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：F3082108），一次性使用無(wú)菌注射器（武漢帝王冠醫(yī)療器械有限責(zé)任公司）；象皮生肌膏（湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一院藥劑科自制，批號(hào)：20120918）及其他相關(guān)材料。

1．1．4 儀器 美國(guó)生產(chǎn)AllegraX－15R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)JY3002型電子天平，德國(guó)LEICA公司產(chǎn)DM LB2型雙目顯微鏡，北航公司產(chǎn) MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，英國(guó)生產(chǎn)的Shandon325型石蠟切片機(jī)，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司生產(chǎn)的Motic B5顯微攝像系統(tǒng)及其他相關(guān)儀器。

1．2 方法

1．2．1 造模 ①選取180只SD健康成年雄性清潔級(jí)大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。然后隨機(jī)選取45只大鼠為空白對(duì)照組，喂養(yǎng)同前；其余135只予高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周，然后從大鼠尾靜脈采血，測(cè)量大鼠C肽及血糖，判斷動(dòng)物出現(xiàn)胰島素抵抗后，再予尾靜脈注射1%鏈脲佐菌素（STZ）30mg／kg，1周后測(cè)血糖≥16．7 mmol／L，則認(rèn)為糖尿病造模成功［2］，成功造糖尿病模型134只。②糖尿病成功造模后，當(dāng)天對(duì)134只糖尿病大鼠制備潰瘍模型［2］，術(shù)前每只大鼠肌肉注射8U～10U的青霉素預(yù)防感染，然后用亞甲藍(lán)在大鼠背部作一直徑17mm圓形標(biāo)記，最后對(duì)大鼠背部脫毛；用碘酒和乙醇對(duì)大鼠背部圓形標(biāo)記脫毛區(qū)消毒，采用打孔器，在大鼠脫毛消毒區(qū)打孔，潰瘍直達(dá)筋膜，然后進(jìn)行清創(chuàng)、止血、包扎；術(shù)后以能自由飲水、攝食者為潰瘍模型，成功造潰瘍模型130只。

1．2．2 動(dòng)物分組方法 從空白對(duì)照組45只SD雄性大鼠中按照隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)抽取40只大鼠。潰瘍模型130只大鼠按照血糖、體重分層隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組選取40只。

1．2．3 治療方法 4組大鼠單籠喂養(yǎng)，換藥前均先用無(wú)菌棉簽蘸取無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行清創(chuàng)，再以1%碘伏消毒，最后以無(wú)菌棉簽對(duì)大鼠局部干燥。模型組予生理鹽水紗布外敷，陽(yáng)性對(duì)照組予水膠體敷料外敷，實(shí)驗(yàn)組予象皮生肌膏外敷。3組每天均換藥1次，肉眼觀察創(chuàng)面癥狀的變化及愈合情況。

1．2．4 療效評(píng)價(jià)方法

1．2．4．1 創(chuàng)面肉眼及組織學(xué)觀察 肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況；顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1．2．4．2 創(chuàng)面TGF－β及FN表達(dá)檢測(cè) 分別于治療后的第1天、第7天、第14天、第21天從每組隨機(jī)選取10只大鼠處死并取相同部位創(chuàng)緣組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟切片，采用免疫組化檢測(cè)TGF－β及FN的表達(dá)，比較4組創(chuàng)面第1天、第7天、第14天、第21天免疫組化檢測(cè)TGF－β和FN陽(yáng)性表達(dá)；在400倍鏡下觀察4組創(chuàng)面第1天、第7天、第14天、第21天免疫組化檢測(cè)TGF－β和FN陽(yáng)性表達(dá)的分布。

1．2．4．3 潰瘍愈合率的計(jì)算 分別在治療后的第1天、第7天、第14天、第21天用數(shù)碼相機(jī)對(duì)大鼠創(chuàng)面照相，采用圖像分析IPP軟件計(jì)算未愈合面積、創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率＝（原始創(chuàng)面面積－未愈合創(chuàng)面面積）／原始創(chuàng)面面積×100%。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，以百分比表示。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 創(chuàng)面潰瘍組織肉眼及組織學(xué)觀察 ①空白對(duì)照組：組織學(xué)無(wú)明顯變化。②模型組：大鼠術(shù)后創(chuàng)面較干燥，色澤暗淡，肉眼生長(zhǎng)緩慢。肉眼觀察大鼠術(shù)后創(chuàng)面第10天開始愈合，絕大多數(shù)大鼠到第21天創(chuàng)面也未完全愈合。組織學(xué)觀察TGF－β表達(dá)在第7天達(dá)峰值，而后逐漸下降；FN表達(dá)一直呈上升趨勢(shì)。③陽(yáng)性對(duì)照組：大鼠術(shù)后創(chuàng)面較濕潤(rùn)，肉芽組織生長(zhǎng)較緩，其色較鮮艷。肉眼觀察術(shù)后大鼠創(chuàng)面第6天開始愈合，在第21天基本愈合。組織學(xué)觀察TGF－β表達(dá)在第7天達(dá)峰值，而后一直下降；FN表達(dá)一直呈上升趨勢(shì)。④實(shí)驗(yàn)組：大鼠術(shù)后創(chuàng)面伴滲出液，肉芽組織生長(zhǎng)較快，呈淡紅色。肉眼觀察術(shù)后大鼠創(chuàng)面在第3天少量大鼠開始愈合，在第16天絕大多數(shù)大鼠基本愈合，在第21天所有大鼠完全愈合。組織學(xué)觀察TGF－β表達(dá)在第7天達(dá)峰值，而后一直下降；FN表達(dá)在第14天達(dá)峰值，而后FN含量開始下降。見封三圖1、圖2。

2．2 4組TGF－β表達(dá)的動(dòng)態(tài)比較 實(shí)驗(yàn)組在第1天、第7天、第14天、第21天TGF－β陽(yáng)性表達(dá)都高于陽(yáng)性對(duì)照組TGF－β陽(yáng)性表達(dá)（P＜0．05），也高于模型組TGF－β陽(yáng)性表達(dá)（P＜0．05）；陽(yáng)性對(duì)照組第1天、第7天、第14天、第21天TGF－β陽(yáng)性表達(dá)均高于模型組TGF－β陽(yáng)性表達(dá)（P＜0．05）。見表1。

表1 4組TGF－β表達(dá)變化比較（±s）

表1 4組TGF－β表達(dá)變化比較（±s）

組別 只數(shù) 第1天 第7天 第14天 第21天4±14．21模型組 10 76．52±13．65 89．51±14．33 76．39±13．55 58．50±10．04陽(yáng)性對(duì)照組 10 124．33±15．98 202．41±16．94 175．90±15．88 136．46±14．82實(shí)驗(yàn)組 10 154．61±16．051） 251．32±17．021） 206．43±16．091） 158．84±15．471）1）與其他3組同時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0．05?？瞻讓?duì)照組 10 95．88±15．47 94．37±17．42 95．34±16．42 95．3

2．3 4組FN表達(dá)的動(dòng)態(tài)比較（見表2）

表2 4組FN表達(dá)動(dòng)態(tài)變化比較（±s）

表2 4組FN表達(dá)動(dòng)態(tài)變化比較（±s）

組別 只數(shù) 第1天 第7天 第14天 第21天00．83±10．51模型組 10 63．21±8．94 95．61±8．73 187．41±12．07 236．42±14．45陽(yáng)性對(duì)照組 10 101．30±10．48 227．00±16．45 298．71±17．06 359．63±17．85實(shí)驗(yàn)組 10 132．00±13．051） 285．00±16．931） 454．33±19．631） 283．60±15．441）1）與另外3組同時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0．05。空白對(duì)照組 10 100．62±10．47 100．30±10．74 100．80±10．63 1

2．4 3組愈合率及愈合時(shí)間動(dòng)態(tài)比較（見表3）

表3 3組潰瘍創(chuàng)面愈合率動(dòng)態(tài)比較（±s） %

表3 3組潰瘍創(chuàng)面愈合率動(dòng)態(tài)比較（±s） %

組別 只數(shù) 第1天 第7天 第14天 第21天36陽(yáng)性對(duì)照組 10 6．52±1．47 33．06±3．63 65．73±5．41 86．35±5．30實(shí)驗(yàn)組 10 10．80±2．141） 44．92±3．741） 86．78±5．011） 100．001）1）與其他兩組同時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0．05。模型組 10 2．33±0．53 22．71±3．98 49．09±4．26 75．04±5．

3 討論

目前2型糖尿病病因尚不十分清楚，其主要病理機(jī)制為胰島素分泌相對(duì)不足或胰島素抵抗，臨床主要表現(xiàn)為血糖高于正常范圍。高血糖導(dǎo)致糖代謝、脂代謝、蛋白代謝等發(fā)生異常，累及心、腦、腎、眼、神經(jīng)等重要臟器；特別是對(duì)糖尿病足部潰瘍，其致殘率高，嚴(yán)重影響病人的日常生活［3］。在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中，糖尿病屬“消渴”范疇，糖尿病足屬“脫疽”范疇，多因勞倦、情志所傷或久病等導(dǎo)致的氣陰兩虛，不能正常行血和濡養(yǎng)臟腑組織，致使脈絡(luò)損傷，而發(fā)為血瘀；久則化熱，而敗壞肌膚筋骨等，演變?yōu)槊摼摇Ｆ洳⌒詫俦咎摌?biāo)實(shí)。根據(jù)中醫(yī)急則治標(biāo)的原則，應(yīng)快速治愈足部潰瘍，防止嚴(yán)重的并發(fā)癥。故本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠2型糖尿病足部潰瘍成功造模，然后通過免疫組化法檢測(cè)TGF－β，F(xiàn)N的分子生物表達(dá)及創(chuàng)面愈合率來評(píng)價(jià)創(chuàng)面愈合效果，對(duì)臨床治療糖尿病足具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

本研究結(jié)果顯示：4組TGF－β的表達(dá)在第7天均達(dá)峰值，而后一直降低；4組FN的表達(dá)只有實(shí)驗(yàn)組最先在第14天達(dá)峰值，其余3組一直處于上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組中大鼠在任意時(shí)間段TGF－β表達(dá)、FN表達(dá)及創(chuàng)面愈合率與其他3組間均存在差異（P＜0．05）。說明2型糖尿病潰瘍大鼠損傷組織中TGF－β，F(xiàn)N在不同時(shí)間段都存在表達(dá)，但是實(shí)驗(yàn)組TGF－β表達(dá)最多、FN能提前表達(dá)且含量最多，故象皮生肌膏對(duì)于2型糖尿病大鼠潰瘍，能快速促進(jìn)肉芽組織TGF－β及FN的表達(dá)，促進(jìn)傷口愈合。

TGF－β是一類具有多功能的細(xì)胞因子，能對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控，從而影響細(xì)胞分裂［4］；能誘導(dǎo)新生肉芽組織生成，加速組織的修復(fù)［5］。FN是一種具有廣泛生物學(xué)特性的糖蛋白，廣泛存在于細(xì)胞表面、體液及結(jié)締組織中，具有防御功能和維持機(jī)體完整性的物質(zhì)；能在創(chuàng)面形成富含F(xiàn)N的基層膠原纖維－纖維蛋白復(fù)合物，并進(jìn)行增殖，直至上皮化愈合，在傷口修復(fù)愈合中起重要作用［6］。所以，損傷組織中TGF－β及FN的表達(dá)能間接反映創(chuàng)面愈合情況。而象皮生肌膏為中成藥制劑，其主要中藥成分為血余碳、生地黃、龜甲、當(dāng)歸、石膏、爐甘石、蜂蠟及象皮。血余碳能活血化瘀、收斂止血，現(xiàn)代研究表明血余碳具有明顯的凝血、抗血栓及抗菌作用［7］；生地黃、龜甲、當(dāng)歸能補(bǔ)氣養(yǎng)血，起扶正固本之作用；石膏、爐甘石能清熱解毒并涼血生肌，具有抗感染作用；蜂蠟及象皮養(yǎng)陰并保持局部組織濕潤(rùn)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合［8，9］。諸藥合用，共奏養(yǎng)血活血、止痛斂瘡，同時(shí)解毒生肌。正如本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用象皮生肌膏大鼠FN在第14天表達(dá)就達(dá)高峰、TGF－β在第7天表達(dá)達(dá)高峰且含量與其余3組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），說明象皮生肌膏能促進(jìn)FN及TGF－β在潰瘍部位的表達(dá)。故應(yīng)用象皮生肌膏大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間最早、愈合率最高?？梢?，對(duì)于糖尿病潰瘍，在現(xiàn)代藥物治療的基礎(chǔ)上，應(yīng)發(fā)揮傳統(tǒng)中醫(yī)特色，使之為人類健康服務(wù)。

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