酞酸酯DMP、DEP和DBP對明亮發(fā)光桿菌的毒性研究

李海燕，王平，劉雯，王心春，尉騰達(dá)

南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037

酞酸酯DMP、DEP和DBP對明亮發(fā)光桿菌的毒性研究

李海燕，王平*，劉雯，王心春，尉騰達(dá)

南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037

酞酸酯（PAEs, phthalate acid esters）是目前最普遍的有機(jī)污染物之一，一定劑量的酞酸酯會產(chǎn)生生殖和發(fā)育毒性等健康危害。以明亮發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum T3）為受試生物，評價了甲醇和3種PAEs [dimethyl phthalate (DMP), diethyl phthalate (DEP), dibutyl phthalate (DBP)]對其劑量—效應(yīng)關(guān)系，以期為酞酸酯暴露風(fēng)險評價提供一定理論依據(jù)。結(jié)果表明，采用Logit和Weibull非線性函數(shù)（全濃度區(qū)間）分別對甲醇和3種PAEs的濃度—效應(yīng)曲線進(jìn)行擬合，效果均優(yōu)于線性函數(shù)（局部濃度區(qū)間）擬合。其中，甲醇的線性與Logit函數(shù)擬合r2分別為0.9592和0.9863，兩者EC50分別為1.185和1.044 mol·L-1，結(jié)果相近。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，采用明亮發(fā)光桿菌測試PAEs急性毒性時，以甲醇為助溶劑（濃度<0.247 mol·L-1，毒性效應(yīng)可忽略）是可行的。在一定濃度范圍內(nèi)，首次以甲醇為助溶劑，以DMP、DEP和DBP 3種PAEs對明亮發(fā)光桿菌進(jìn)行毒性測試。線性擬合DMP、DEP和DBP對明亮發(fā)光桿菌的濃度-效應(yīng)曲線，擬合r2分別為0.9262、0.9214、0.9339，其EC50分別為2.64E-04、2.79E-04和1.14E-05 mol·L-1。與此同時，3組PAEs毒性數(shù)據(jù)均能以Weibull函數(shù)進(jìn)行非線性擬合，r2分別為0.9749、0.9742和0.9648，效果良好，其EC50分別為1.49E-04、2.72E-04和9.00E-06 mol·L-1。兩種擬合結(jié)果表明，Weibull函數(shù)非線性擬合效果更優(yōu)，半致死濃度 EC50結(jié)果相近。由上述結(jié)果可知，以甲醇為助溶劑時，DMP、DEP和 DBP分別在6.14E-9～6.14E-3、5.04E-5～2.52E-3和3.76E-9～3.76E-5 mol·L-1濃度范圍內(nèi)，3種PAEs對明亮發(fā)光桿菌的急性毒性強(qiáng)弱為DBP>DMP>DEP。在上述濃度范圍內(nèi)，DMP、DEP和DBP對明亮發(fā)光桿菌的抑制率分別為96.87%、95.24%和88.35%。關(guān)鍵詞：酞酸酯（PAEs）；DMP；DEP；DBP；明亮發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）

酞酸酯（鄰苯二甲酸酯類化合物，PAEs）是重要的工業(yè)產(chǎn)品（陳波和林建國，2009），被廣泛用于塑制品、化妝品、涂料等生產(chǎn)領(lǐng)域。范德華力與氫鍵力使酞酸酯易于向外界環(huán)境遷移擴(kuò)散，從而成為最普遍的有機(jī)污染物之一。大量實驗與統(tǒng)計表明，一定劑量PAEs會產(chǎn)生生殖和發(fā)育毒性等健康危害（McKee等，2006；Grande等，2007；Boberg等，2011；Guerra等，2010；Bradlee等，2003；Hines等，2011；黃昕和厲曙光，2004；Guo等，2011；Heudorf等，2007；Herr等，2009；Irvin等，2010）。目前已有部分PAEs被相關(guān)機(jī)構(gòu)確定為環(huán)境優(yōu)先控制污染物。然而，國內(nèi)外關(guān)于酞酸酯的暴露劑量—效應(yīng)關(guān)系研究基本處于空白狀態(tài)，目前已建立關(guān)于酞酸酯劑量—效應(yīng)關(guān)系曲線的準(zhǔn)確報道很少（Wang等，2015）。

發(fā)光細(xì)菌是生物毒理學(xué)領(lǐng)域重要的研究受試生物之一，已被廣泛用于重金屬、農(nóng)藥等物質(zhì)的急性毒性測定和研究（韋東普等，2008；Su等，2012；Zou等，2012）。本研究以明亮發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum T3）為受試生物，測定分析鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）和鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的毒性效應(yīng)。由于上述3種PAEs溶解度較小，實驗中以甲醇為助溶劑，在研究其對明亮發(fā)光桿菌的毒性影響基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其為助溶劑狀態(tài)下3種PAEs對明亮發(fā)光桿菌的毒性效應(yīng)，以期為酞酸酯毒性研究及暴露風(fēng)險評價提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：DXY-3型生物毒性測試儀，購自南京中科院跨克科技有限責(zé)任公司；海門其林貝爾VORTEX-5渦旋混合器，購自上海精密科學(xué)儀器有限公司。

試劑：甲醇（AR），氯化鈉（AR），兩者均購自南京化學(xué)試劑有限公司，鄰苯二甲酸二甲酯（DMP，AR），鄰苯二甲酸二乙酯（DEP，AR），鄰苯二甲酸二丁酯（DBP，AR），3種PAEs均購自上海凌風(fēng)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 檢測生物

明亮發(fā)光桿菌 T3小種（Photobacterium phosphoreum T3）凍干粉，購自中國科學(xué)院南京土壤研究所。T3小種凍干粉，安剖瓶包裝，每瓶0.5 g，在2～5 ℃冰箱內(nèi)保存，有效期為6個月。使用前采用2.5%氯化鈉溶液進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇菌液置于裝有冰塊的保溫瓶中備用。

1.3 毒性檢測方法

甲醇的毒性檢測方法：用去離子水將甲醇稀釋成一系列濃度溶液，按照GB/T 15441—1995進(jìn)行測定。

PAEs毒性檢測方法：采用甲醇作為助溶劑配制DMP、DEP及DBP的儲備液，使得三者儲備液濃度分別為0.0614、0.0504、0.000376 mol·L-1。再用去離子水將各PAEs儲備液稀釋成系列濃度，按照GB/T 15441—1995進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對明亮發(fā)光桿菌T3小種濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，利用orgin8.5軟件，采用Logit和Weibull函數(shù)進(jìn)行非線性擬合（李曉磊等，2013；葛會林等，2006；鄧輔財?shù)龋?007；王成林等，2012）。選取均方根誤差較小及相關(guān)系數(shù)較大的函數(shù)作為最佳擬合函數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 明亮發(fā)光桿菌活性檢測

將HgCl2與其對應(yīng)平均相對發(fā)光度進(jìn)行一元一次線性回歸，得到一元一次線性相關(guān)方程為T=-506.53 C+104.7，r2=0.9929，對相關(guān)系數(shù)r2開根號，得r=0.9964，查得P=0.01顯著水平下的臨界值r（9）=0.735，則該回歸方程線性關(guān)系在統(tǒng)計學(xué)上擬合效果顯著。將 T=50代入方程，求得 HgCl2對明亮發(fā)光桿菌的EC50值為0.1080 mg·L-1。根據(jù)檢測方法，當(dāng)HgCl2的EC50值在（0.10±0.02）mg·L-1時，則認(rèn)為發(fā)光細(xì)菌活性正常。

2.2 甲醇對明亮發(fā)光桿菌的單一毒性效應(yīng)

甲醇對明亮發(fā)光桿菌的毒性影響結(jié)果見表 1。由表1可知，在甲醇濃度為0.00247～24719 mol·L-1，抑制時間為15 min時，線性擬合回歸方程相關(guān)系數(shù)為0.9592，效果良好，其EC50值為1.185 mol·L-1。而甲醇對明亮發(fā)光桿菌的抑制曲線及劑量—效應(yīng)關(guān)系曲線分別見圖1和圖2。

圖1 不同稀釋倍數(shù)下甲醇對明亮發(fā)光桿菌的抑制率Fig. 1 Inhibition ratio of methanol to Photobacterium phosphoreum T3 at different dilution multiples

圖2 甲醇對明亮發(fā)光桿菌的濃度-效應(yīng)曲線Fig. 2 Dose-response curve of methanol to Photobacterium phosphoreum T3

表1 甲醇及3種PAEs對明亮發(fā)光桿菌的毒性效應(yīng)線性擬合Table 1 Linear fitting of toxicity effects of methanol and the three PAEs on Photobacterium phosphoreum T3

2.3 PAEs對明亮發(fā)光桿菌的毒性效應(yīng)

以甲醇為助溶劑，分別測試明亮發(fā)光桿菌對不同濃度DMP、DEP、DBP 3種酞酸酯的致毒效應(yīng)，得到DMP、DEP和DBP對明亮發(fā)光桿菌的濃度-效應(yīng)曲線，分別見圖3、圖4和圖5。在一定濃度范圍內(nèi)，將3種PAEs對明亮發(fā)光桿菌濃度效應(yīng)曲線進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見表1。

圖3 DMP對明亮發(fā)光桿菌的濃度-效應(yīng)曲線Fig. 3 Dose-response curve of DMP to Photobacterium phosphoreum T3

圖4 DEP對明亮發(fā)光桿菌的濃度-效應(yīng)曲線Fig. 4 Dose-response curve of DEP to Photobacterium phosphoreum T3

圖5 DBP對明亮發(fā)光桿菌的濃度-效應(yīng)曲線Fig. 5 Dose-response curve of DBP to Photobacterium phosphoreum T3

3 討論

3.1 甲醇對明亮發(fā)光桿菌的單一毒性效應(yīng)

圖1顯示，當(dāng)純甲醇稀釋倍數(shù)<5時，甲醇溶液對明亮發(fā)光桿菌有完全致死效應(yīng)。稀釋倍數(shù)在5～100區(qū)間時，對稀釋倍數(shù)和抑制率進(jìn)行線性擬合，得到表1中所擬合的方程。以y=50代入該方程，得到甲醇EC50對應(yīng)稀釋倍數(shù)為32倍，對應(yīng)甲醇的EC50=37.82 mg·mL-1，這與賈繼民等（2012）研究的結(jié)果相近。當(dāng)稀釋倍數(shù)大于100時，甲醇溶液對明亮發(fā)光桿菌的抑制率基本平緩，且接近于零，此時微量的甲醇對明亮發(fā)光桿菌的毒性效應(yīng)基本可以忽略。在常溫下PAEs溶解度很小，待測溶液配制過程中，稀釋倍數(shù)遠(yuǎn)大于 100（甲醇濃度<0.247 mol·L-1），采用明亮發(fā)光桿菌測試PAEs急性毒性時，以甲醇為助溶劑是可行的。

以往研究絕大多數(shù)均使用線性擬合或?qū)?shù)函數(shù)擬合，但當(dāng)有毒物質(zhì)對生物體劑量達(dá)到足夠大時，生物體應(yīng)該區(qū)域平緩的“死亡期”，即劑量效應(yīng)曲線趨于“平臺”（李興春等，2011），所以對于整個劑量區(qū)間僅采用線性擬合是不準(zhǔn)確的。采用Logit模型公式（1）對甲醇劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行擬合（圖2），可以有效解決該問題。

其中，相關(guān)系數(shù) r2=0.9863，擬合效果良好，擬合結(jié)果得到明亮發(fā)光桿菌半致死效應(yīng)EC50=1.044 mol·L-1，即33.408 mg·mL-1，與前述線性擬合結(jié)果相近。

3.2 PAEs對明亮發(fā)光桿菌的毒性效應(yīng)

表1顯示，3種PAEs的擬合曲線相關(guān)系數(shù)在0.9214～0.9339之間，DMP、DEP、DBP分別對應(yīng)的EC50值為2.64E-04、2.79E-04和1.14E-05 mol·L-1。該數(shù)據(jù)顯示3種PAEs對明亮發(fā)光桿菌的致毒效應(yīng)大小順序為：DBP>DMP>DEP。

以甲醇為助溶劑，DMP、DEP和DBP對明亮發(fā)光桿菌的濃度-效應(yīng)曲線顯示，3種PAEs對發(fā)光細(xì)菌的致毒效應(yīng)均隨著濃度增加而愈發(fā)明顯。3種效應(yīng)曲線均為采用Weibull非線性函數(shù)公式（2）進(jìn)行擬合所得，其相關(guān)系數(shù)分別為 0.9749、0.9742和0.9648，顯示擬合效果優(yōu)于線性擬合中的相關(guān)系數(shù)，其他相關(guān)參數(shù)見表2。

DMP、DEP和DBP 3種PAEs對明亮發(fā)光桿菌的半致死效應(yīng)濃度 EC50值分別為 1.49E-04、2.72E-04和9.00E-06 mol·L-1。該數(shù)據(jù)顯示，水體中3種PAEs對明亮發(fā)光桿菌的致毒效應(yīng)大小順序為：DBP>DMP>DEP。

表2 3種PAEs對明亮發(fā)光桿菌毒性效應(yīng)的Weibull函數(shù)擬合Table 2 Weibull fitting of toxicity effects of the three PAEs on Photobacterium phosphoreum T3

與線性擬合結(jié)果相比，以Weibull非線性函數(shù)擬合所得DMP和DEP的EC50值均在同一個數(shù)量級，后者DMP的EC50值稍小，DEP的EC50值幾乎相等。兩種擬合條件下DBP的EC50的值雖然相差一個數(shù)量級，但是數(shù)值是相近的。上述結(jié)果表明，對3種PAEs的兩種擬合結(jié)果是相符的。

圖3、圖4和圖5顯示，3種PAEs最大抑制率的對應(yīng)濃度基本接近相應(yīng)的溶解度。DMP、DEP、DBP 3種PAEs的濃度區(qū)間依次為6.14E-9～6.14E-3、5.04E-5～2.52E-3和3.76E-9～3.76E-5 mol·L-1。其中，DMP與DBP的濃度區(qū)間跨越范圍較寬，而DEP的濃度區(qū)間只有兩個數(shù)量級，表明明亮發(fā)光桿菌對DMP和DBP更敏感，水體中含有極微量的DMP和DBP都會對發(fā)光細(xì)菌造成威脅。而DEP對明亮發(fā)光桿菌的致毒效應(yīng)相對弱一些，盡管如此，水體中微量的DEP也會對發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生致毒作用。與此同時，DBP與DMP在達(dá)到相同致毒效應(yīng)時，所需濃度更低，也即 DBP對發(fā)光細(xì)菌的致毒性更強(qiáng)，這可能與相對分子量較大相關(guān)。

將PAEs與甲醇對明亮發(fā)光桿菌的濃度-效應(yīng)曲線進(jìn)行對比，甲醇對發(fā)光細(xì)菌的濃度-效應(yīng)曲線與Logit函數(shù)的擬合效果更佳，而PAEs的致毒效應(yīng)曲線更適合Weibull函數(shù)。甲醇的致毒濃度區(qū)間在一個數(shù)量級以內(nèi)，故而適合于 Logit函數(shù)。而 PAEs的濃度-效應(yīng)曲線致毒濃度區(qū)間跨越數(shù)量級范圍較大，曲線相對平緩，適合于Weibull函數(shù)。其中差別可能是由這些有機(jī)物的分子量決定的。

圖3、圖4、圖5顯示，DMP、DEP和DBP對明亮發(fā)光桿菌的最大抑制率分別為 96.87%、95.24%和88.35%。DMP與DEP的最大抑制率基本接近100%，可視為達(dá)到完全致毒效應(yīng)。而DBP并沒有達(dá)到完全致毒效應(yīng)，高濃度區(qū)抑制率也沒有出現(xiàn)平緩趨勢。這可能是受到常溫下水體中 DBP溶解度制約的結(jié)果。

4 結(jié)論

在常溫下PAEs溶解度很小，采用明亮發(fā)光桿菌測試PAEs急性毒性時，在一定條件下微量的甲醇對明亮發(fā)光桿菌的毒性效應(yīng)基本可以忽略，以甲醇為助溶劑是可行的。在一定濃度區(qū)間內(nèi)對甲醇的急性毒性效應(yīng)曲線進(jìn)行線性擬合，其EC50為37.82 mg·mL-1，在全區(qū)間內(nèi)進(jìn)行Logit擬合，其EC50為1.044 mol·L-1，即33.408 mg·mL-1，兩者擬合結(jié)果相符。以甲醇為助溶劑，在一定范圍內(nèi)，線性擬合DMP、DEP和DBP對明亮發(fā)光桿菌的濃度-效應(yīng)曲線，分別對應(yīng)的 EC50值為 2.64E-04、2.79E-04和1.14E-05 mol·L-1。而在全濃度區(qū)間范圍內(nèi)采用Weibull非線性函數(shù)擬合，分別對應(yīng)的 EC50值為1.49E-04、2.72E-04和9.00E-06 mol·L-1，兩者結(jié)果相近，3種 PAEs致毒效應(yīng)大小順序為DBP>DMP>DEP。

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Study on Toxicity of Phthalate Acid Esters (PAEs) to Photobacterium phosphoreum

LI Haiyan, WANG Ping*, LIU Wen, WANG Xinchun, WEI Tengda
College of Biology and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China

Phthalate acid esters (PAEs) are one of the most common organic pollutants currently. A dose of PAEs would bring about health hazards such as reproductive and developmental toxicity. To provide some academic evidence of exposure and risk assessment to PAEs, the dose-response of methanol and the three PAEs (DMP, DEP and DBP) to Photobacterium phosphereum T3 was evaluated. The results showed that, the dose-response of methanol and the three PAEs could be separately better non-linear fitted by Logit and Weibull equations (in full concentration range) compared to linear fitting (part of the concentrations). For methanol, the correlation coefficients R2of linear fitting and non-linear fitting were 0.9592 and 0.9863 separately. And their EC50calculated by both ways were similar with results of 1.185 and 1.044 mol·L-1. The data results showed that it was feasible for methanol (with concentration of < 0.247 mol·L-1) to act as co-solvents for the three PAEs (DMP, DEP and DBP) in acute toxicity test. The toxicity assessment of the three PAEs to Photobacterium phosphoreum T3 was performed in certain doses. Linear fitting was executed for the dose-response curves of DMP, DEP and DBP. Their EC50values were 2.64E-04, 2.79E-04 and 1.14E-05 mol·L-1, while the three correlation coefficients r2were 0.9262, 0.9214 and 0.9339, respectively. In the meantime all the data could be well non-linear fitted by Weibull equation (in full concentration range). Their correlation coefficients R2were 0.9749, 0.9742 and 0.9648 respectively. The results were satisfied and their EC50values were 1.49E-04, 2.72E-04 and 9.00E-06 mol·L-1. The both fitted data expressed that the Weibull non-linear was more fitted and their EC50values were similar. By the results, for DMP, DEP and DBP with respective concentration ranges of 6.14E-9～6.14E-3, 5.04E-5～2.52E-3 and 3.76E-9～3.76E-5 mol·L-1, the acute toxicity to Photobacterium phosphoreum T3 was DBP > DMP > DEP. In the concentration ranges, the inhibiton ratios for DMP, DEP and DBP were 96.87%, 95.24% and 88.35% respectively.

phthalate acid esters; dimethyl phthalate; diethyl phthalate; dibutyl phthalate; Photobacterium phosphoreum

X503

A

1674-5906（2015）01-0121-05

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.01.018

李海燕，王平，劉雯，王心春，尉騰達(dá). 酞酸酯DMP、DEP和DBP對明亮發(fā)光桿菌的毒性研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2015, 24(1): 121-125.

LI Haiyan, WANG Ping, LIU Wen, WANG Xinchun, WEI Tengda. Study on Toxicity of Phthalate Acid Esters (PAEs) to Photobacterium phosphoreum [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(1): 121-125.

國家自然科學(xué)基金面上項目（31270680）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科（環(huán)境科學(xué)與工程）建設(shè)工程資助項目

李海燕（1988年生），女，碩士，主要研究領(lǐng)域水污染控制。E-mail: lihaiyan25204@126.com *通信作者：王平（1962年生），女，教授，博士，江蘇省“六大高峰人才”入選者。從事酞酸酯健康毒理學(xué)的研究。E-mail: wp_lh@aliyun.com

2014-03-02