白藜蘆醇對香煙煙霧提取物誘導的血管內皮細胞早衰的干預作用研究＊

曾 智，王 濤

廣州醫科大學第一附屬醫院 心血管內科（廣州 510120）

動脈粥樣硬化是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的主要病理基礎，嚴重威脅人類生命健康。吸煙是公認的動脈粥樣硬化發展的獨立危險因素，可導致內皮功能紊亂、炎癥反應增加、血脂代謝異常和血管內血栓形成，易誘發急性心血管事件［1］。近年來研究發現，內皮細胞早衰是動脈粥樣硬化等心血管病變的重要風險因子，細胞早衰與線粒體功能密切相關。白藜蘆醇屬于酚類植物抗毒素，具有調節脂質代謝、改善血管內皮功能和抑制血管炎癥反應等作用［2］。此外，白藜蘆醇還能調節血管內皮細胞凋亡，但目前研究較少。因此本研究通過設計對照實驗，探討白藜蘆醇對吸煙誘導血管內皮細胞早衰的干預作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內皮細胞株HuVEes，購自Caseade Biologies公司；濃度為1×10－3mol/L的白藜蘆醇，購自Sigma公司；香煙煙霧提取物（CSE），分別配成1%、5%和10%的CSE培養基；DMEM培養基、PBS緩沖溶液、雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/m）、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco公司；端粒酶活性檢測試劑盒（ELISA）、活性氧（ROS）檢測試劑盒和線粒體分離試劑盒購自碧云天生物科技公司；β－半乳糖苷酶染色試劑盒購自南京建成生物技術公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞培養與分組給藥

人臍靜脈內皮細胞株培養于DMEM培養液中，加入10%胎牛血清，在37℃、5%CO2培養箱中傳代培養，每2～3d更換培養液，5～6d細胞達80%～90%融合時傳代。本實驗使用第3代細胞。人臍靜脈內皮細胞以2×105/mL密度接種至6孔板（3mL/孔），實驗分為正常對照組（N組）、CSE組（C組）和白藜蘆醇組20μM（R組），其中后兩組根據CSE培養基濃度不同分為6個小組：C1（1%）、R1（1%）、C2（5%）、R2（5%）、C3（10%）和 R3（10%）。每組培養48h，于12、24和48h作對照研究。實驗中各組的每個孔均設4個復孔，重復3次實驗。

1.3 觀察指標

1.3.1 不同時間點各組細胞增殖情況 以 MTT比色法測定各組內皮細胞增殖率。在培養基中加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，培養4h，用槍頭吸棄培養基，在每孔中加入150μL DMSO，置于37℃搖床輕搖20min，使DMSO溶解，用酶標儀讀取其OD570。按照公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率＝（對照組吸光度－實驗組吸光度）/對照組吸光度×100%。

1.3.2 β－半乳糖苷酶染色 將內皮細胞接種于6孔板中，分組干預后，吸除細胞培養液，PBS清洗，0.5%戊二醛固定細胞3～5min。PBS洗3次，各孔加入1mL新配置的X－gal染液，37℃無CO2條件下孵育12～16h，熒光顯微鏡下每組標本隨機選取視野，至少觀察1 000個細胞，細胞質藍染者為衰老細胞，計算陽性細胞占觀察細胞總數的百分比。

1.3.3 端粒酶活性 應用PCR－ELISA法檢測：以0.25%胰蛋白酶消化、收集2×106個細胞，余步驟按試劑盒說明書操作，酶標儀讀數并計算端粒酶的相對活性。

1.3.4 線粒體細胞色素C氧化酶活性 使用標準曲線測定：取0.18mmoL/L Cyt C標準液3mL稀釋至30mL，分別取稀釋液2、4、6、8和10mL放于試管中，加蒸餾水至15mL，每管加少許連二亞硫酸鈉，520nm處測定光密度；以水作為空白對照，以標準品的濃度為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線作為定量依據；取所得的線粒體懸液超聲破碎儀破碎3次以破壞線粒體膜，取線粒體懸液1.5mL，加入少許連二亞硫酸鈉搖勻，520nm處測定光密度，根據所得標準曲線計算其濃度。

1.3.5 內皮細胞內ROS水平 細胞干預后胰酶消化，使細胞密度為2×106/mL。用無血清培養液按照1∶1 000稀釋DCFH－DA，使終濃度為10mol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH－DA中，37℃細胞培養箱內孵育20min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，流式細胞儀檢測至少10 000個細胞的平均熒光強度。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行數據分析。計數資料用秩和檢驗，計量資料用方差分析或t檢驗，相關性研究采用單因素回歸分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染后各組細胞的增殖情況

細胞生長速度隨CSE濃度升高而降低（P＜0.05），白藜蘆醇各組在不同濃度CSE作用下，細胞增殖速度差異無統計學意義（P＞0.05），且不同時間點白藜蘆醇各組細胞增殖速度優于CSE組，差異有統計學意義（P＜0.05）。白藜蘆醇在12、24和48h均能改善CSE誘導的內皮細胞增殖抑制，說明白藜蘆醇可干預CSE導致的內皮細胞早衰（圖1）。

2.2 β－半乳糖苷酶染色檢測結果

不同時間點CSE組的β－半乳糖苷酶染色陽性細胞數隨濃度升高而增多（P＜0.05），而白藜蘆醇各組在不同濃度CSE作用下，β－半乳糖苷酶染色陽性細胞數低于CSE組，差異有統計學意義（P＜0.05）。白藜蘆醇在12、24和48h均能改善CSE誘導的內皮細胞衰老，降低β－半乳糖苷酶染色陽性細胞率（表1）。

圖1 不同時間各組MTT增殖檢測結果圖

表1 β－半乳糖苷酶染色檢測結果

2.3 端粒酶活性檢測結果

不同時間點CSE組的端粒酶活性率隨CSE濃度升高而降低（P＜0.05），而白藜蘆醇各組在不同濃度CSE作用下，端粒酶活性率高于CSE組，差異有統計學意義（P＜0.05）。白藜蘆醇在12、24和48 h均能改善CSE誘導的內皮細胞端粒酶活性的降低（表2）。

表2 端粒酶活性檢測結果（%）

2.4 線粒體細胞色素C氧化酶活性檢測結果

不同時間點CSE組的細胞色素C氧化酶活性隨CSE濃度升高而降低（P＜0.05），而白藜蘆醇各組在不同濃度CSE作用下，細胞色素C氧化酶活性高于CSE組，差異有統計學意義（P＜0.05）。白藜蘆醇在12、24和48h均能改善CSE誘導的內皮細胞色素C氧化酶活性的降低（表3）。

表3 線粒體細胞色素C氧化酶活性檢測結果

2.5 ROS檢測結果

不同時間點CSE組的細胞ROS水平隨CSE濃度升高而升高（P＜0.05），而白藜蘆醇各組在不同濃度CSE作用下，細胞ROS水平低于CSE組，差異有統計學意義（P＜0.05）。白藜蘆醇在12、24和48h均能改善CSE誘導的內皮細胞ROS水平的升高（表4）。

表4 ROS檢測結果

3 討論

吸煙對人體心血管系統危害嚴重，它通過損害血管內皮細胞、減少NO生物合成、誘導黏附分子表達異常、促進炎癥反應以及血脂代謝紊亂等，獨立增加動脈粥樣硬化風險，甚至引發腦卒中等急性臨床事件［3］。吸煙與動脈粥樣硬化的關系雖有眾多研究報道，但其精確機制目前尚未闡明［4］。

細胞衰老（cellular senescence）是細胞停止增殖而處于細胞周期阻滯的一種狀態，與周圍組織衰老密切相關。內皮細胞生理活動的維持依賴正常的線粒體結構和功能。血管內皮細胞生長、增殖、凋亡、衰老及死亡等細胞過程均參與了動脈粥樣硬化的發生與病理演變。近年有研究［5］指出，內皮細胞早衰是動脈粥樣硬化等心血管病變的重要風險因子，而細胞早衰與線粒體功能密切相關。其中，β－半乳糖苷酶染色是公認的鑒定內皮細胞衰老的生物學標志；線粒體細胞色素C氧化酶活性、端粒酶活性、細胞內ATP水平和細胞內ROS水平是目前常用的反映線粒體功能的指標［6］。內皮細胞衰老是血管整體老化的重要病理改變之一，也是血管老化與心血管疾病之間的重要交互環節［7］。因此，內皮細胞早衰一直是血管老化研究的重點領域，深入探討其發生機制，尋找有效干預措施，對心腦血管疾病的防治具有重要意義。

白藜蘆醇是一種天然活性成分，虎杖、花生和桑椹等植物中含有此種成分，它能以游離態和糖苷結合態兩種形式存在，具有抗氧化效能，其中反式異構體的生物活性強于順式，是一種重要的植物抗毒素。近年來，白藜蘆醇的潛在抗衰老及心血管保護作用備受關注［8－9］。白藜蘆醇具有調節血脂、抑制血小板凝集、抗血栓形成、保護血管內皮及平滑機細胞、舒張血管、抑制血管炎癥反應和抗氧化應激等作用。近期研究發現，白藜蘆醇還具有顯著的調節血管內皮細胞凋亡的作用［10］，但目前對白藜蘆醇抗內皮細胞衰老的作用機制研究較少。

本研究通過設計對照實驗，探討白藜蘆醇對吸煙誘導的血管內皮細胞早衰的干預作用。結果表明：白藜蘆醇在12、24和48h均能改善不同濃度CSE誘導的內皮細胞增殖抑制，說明白藜蘆醇可干預CSE導致的內皮細胞早衰。同時白藜蘆醇在12、24和48h均能改善CSE誘導的內皮細胞端粒酶活性和細胞色素C氧化酶活性的降低，并能降低β－半乳糖苷酶染色陽性細胞率和細胞內ROS水平。表明白藜蘆醇可改善吸煙誘導的血管內皮細胞線粒體功能紊亂、減緩內皮細胞衰老，從而降低發生心血管病變的風險。

綜上所述，白藜蘆醇以內皮細胞線粒體功能為標靶，抑制吸煙引起的血管內皮細胞線粒體功能異常及細胞早衰，有效預防動脈粥樣硬化的發生，有望為動脈粥樣硬化引起的心血管疾病的臨床防治提供新的方向與循證醫學證據，具有一定的應用前景和臨床價值。

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