木補對心肌缺血大鼠ST段及Omentin－1/iNOS和TGF－β1/JNK通路的影響

楊 雅，劉 霞

涼山州第二人民醫院（西昌 615000）

心肌缺血是由心臟血液灌注減少導致心臟供氧不足的一種病理狀態，其常見誘因為冠狀動脈阻塞、血液黏度增高、超氧陰離子和氧自由基引起的過氧化損傷等［1］。 木補即異葉澤蘭（Eupatorium heterophyllumDC.）［2］，多年生草本，甘苦微溫之品，澤蘭屬，主產于涼山州地區。《雙柏彝醫書》及現代《云南中草藥》記載，木補為一種常用的活血化瘀中草藥，毒副作用小。資料［3］顯示，澤蘭的主要化學成分為迷迭香酸、熊果酸、齊墩果酸、胡蘿卜苷、原兒茶酸、乙酰熊果酸、咖啡酸和香茶菜素等酚酸類，具有擴張微血管、改善微循環、增加紅細胞流動性、拮抗血栓形成以及降低血液黏度等藥理作用，因而其可能成為一種新的治療心肌缺血的民族特色藥物。本研究通過觀察心肌缺血大鼠ST段改變及血清網膜素－1（Omentin－1）和血漿轉化生長因子β1（TGF－β1）相關指標的變化，探討彝藥木補對心肌缺血大鼠的治療作用，并采用 Western－blot法對心臟內JNK1/2和iNOS蛋白的表達進行檢測，旨在揭示彝藥木補治療心肌缺血大鼠的可能機制，以期為心肌缺血的防治提供新的中草藥依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠30只，雌雄兼用，月齡3個月，體質量250～300g，購自四川大學華西醫學中心實驗動物中心，合格證號：SCXK（川）2014～6。

1.2 實驗藥物及主要試劑儀器

彝藥木補購自涼山州中藥材有限責任公司；戊巴比妥鈉購自上海江萊生物科技有限公司；垂體后葉素（Pit）購自美國Promega公司；大鼠 Omentin－1 ELISA Kit購自 R＆D公司；大鼠 TGF－β1ELISA Kit購自美國GBD公司；牛血清白蛋白購自美國Sigma 公司；p－JNK1/2 兔源一抗購自美國NovusBiologicals公司；iNOS兔源一抗購自美國santacruz公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG購自北京博爾西科技有限公司；ELx酶標儀由美國Bio－Tek Instruments Inc公司生產；心電圖機由SCHILLER AG公司生產；旋轉蒸發儀由德國Heidolph生產；電泳儀和轉膜儀由上海俊仕生物科技有限公司提供；高速冷凍離心機由北京泰澤瑞達科技有限公司提供。

1.3 彝藥木補水煎劑的制備

準確稱取彝藥木補100g，雙蒸水浸泡，文火煎煮，多層紗布過濾，旋轉蒸發儀濃縮成1g生藥/mL，除菌后4℃保存。

1.4 分組給藥

將30只SD大鼠隨機分成正常對照組、心肌缺血模型組、木補低劑量組［0.8g生藥/（kg·d）］、木補中劑量組［2g生藥/（kg·d）］和木補高劑量組［4 g生藥/（kg·d）］。各給藥組大鼠灌服不同濃度的木補水煎劑，連續給藥6d，正常對照組及心肌缺血組灌服等量生理鹽水。

1.5 心肌缺血模型制備

各組大鼠干預處理6d后，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉（0.2mL/100g）麻醉。固定并記錄各組大鼠注射Pit前的心電圖，10min后除正常對照外其余各組大鼠尾靜脈注射Pit（1.5U/kg），正常對照組注射等量生理鹽水。記錄注射Pit后10min時各組大鼠的心電圖變化情況，計算注射Pit后10 min時各組心電圖ST段的上移幅度均值。

1.6 ELISA法檢測Omentin－1、TGF－β1的變化

各組大鼠于注射Pit后20min心臟采血，用于ELISA檢測。做3次生物學重復。

1.7 Western－blot法檢測iNOS和p－JNK1/2的表達

各組大鼠注射Pit后20min，取大鼠心臟。提取心臟總蛋白并定量后，進行SDS－PAGE電泳，電印跡轉移法轉膜，5%蛋白封閉液搖床封閉2h，4℃過夜孵育一抗（稀釋度1∶1 000），TBST洗膜6次；HRP標記的二抗（稀釋度1∶5 000）搖床孵育45 min，TBST洗膜6次，ECL法顯色、曝光，暗室洗片，并進行數據分析。做3次生物學重復。

1.8 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件分析實驗數據，用均數±標準差（±s）表示，用t檢驗比較組間數據，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同劑量木補對心肌缺血大鼠模型心電圖的影響

心肌缺血模型組大鼠注射Pit后10min，ST段上移幅度為（0.67±0.03）mV，正常對照組ST段無變化，兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。低、中、高劑量木補連續灌服大鼠6d后，與心肌缺血模型組比較，中、高劑量木補均能顯著降低心肌缺血大鼠ST段上移幅度（P＜0.05）（表1）。

表1 不同劑量木補對心肌缺血大鼠ST段上移幅度的影響（mV）

2.2 不同劑量木補對心肌缺血大鼠Omentin－1、TGF－β1的影響

各組大鼠注射Pit后10min，心肌缺血模型組Omentin－1和TGF－β1分泌量分別為30.81ng·L－1和143.41ng·L－1，正常對照組 Omentin－1和 TGF－β1分泌量分別為67.13ng·L－1和71.74ng·L－1，兩組比較，差異有顯著統計學意義（P＜0.05）。低、中、高劑量木補連續灌服大鼠6d后，與心肌缺血模型組進行比較，高劑量木補能升高心肌缺血大鼠血清Omentin－1水平（P＜0.05）；中、高劑量木補能夠顯著降低心肌缺血大鼠血漿TGF－β1（P＜0.05）（圖1）。

圖1 不同劑量木補對心肌缺血大鼠Omentin－1、TGF－β1的影響

2.3 不同劑量木補對心肌缺血大鼠iNOS和p－JNK1/2蛋白表達的影響

各組大鼠注射Pit后10min，心肌缺血模型組大鼠JNK1/2磷酸化水平提高，iNOS表達水平降低，與正常對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；低、中、高劑量木補連續灌服大鼠6d后，與心肌缺血模型組比較，高劑量木補能顯著降低心肌缺血大鼠心臟JNK1/2的磷酸化水平（P＜0.05），也能顯著升高心肌缺血大鼠iNOS表達量（P＜0.05）（圖2）。

圖2 不同劑量木補對心肌缺血大鼠p－JNK1/2、iNOS蛋白表達的影響

3 討論

近年來臨床實踐［4］發現，中草藥可通過抑制化學趨化因子產生、調節轉化生長因子水平、提高血液NO分泌量以及促進相關脂肪因子表達等方式治療心肌缺血。彝藥木補的化學成分主要為酚酸類及三萜酸類化合物，能活血化瘀、擴張血管活性，對心血管疾病可能有較好的治愈作用。基于此，本研究通過建立大鼠心肌缺血模型，以大鼠心電圖ST段改變及血液活性因子為研究指標，闡明彝藥木補的抗心肌缺血功效。冠狀動脈阻塞引起的心臟供血不足是導致ST段抬高的主要誘因，并可進一步演化為心肌損傷、心肌微循環障礙、心律失常以及心肌舒縮障礙等病理特征，其中ST段抬高是心肌缺血患者血液灌注異常的主要臨床表現［5］，因此及時監測其心電圖ST段變化情況，合理降低其ST段上移幅度，可有效控制和治療疾病。本研究實驗結果顯示，尾靜脈注射Pit，模型組大鼠ST段抬高幅度顯著高于正常對照組，表明心肌缺血模型制備成功。給予中、高劑量彝藥木補預處理6d后，能顯著降低心肌缺血大鼠心電圖ST段抬高幅度，提示彝藥木補可改善心肌缺血大鼠心電圖體征，并控制其病程的惡化。為揭示彝藥木補降低心肌缺血大鼠心電圖ST段抬高幅度的可能機制，本研究擬以血清Omentin－1和血漿TGF－β1作為研究對象，分別對心肌缺血大鼠 Omentin－1/iNOS系統和 TGF－β1/JNK1/2通路進行探討。

Omentin即脂肪因子，是一種分泌蛋白，有Omentin－1和 Omentin－2兩種亞型，其中 Omentin－1可與血管內皮相應受體結合，激活體內iNOS蛋白活性，從而促進血管內NO產生，能改善血管內皮細胞功能、抑制血管鈣化形成、促進血管再生、恢復毛細血管密度活性，從而廣泛參與對心血管疾病的調控過程［6］。Zhong等［7］研究表明，冠狀動脈疾病患者Omentin－1水平較健康組低，與本實驗結果相符。本實驗結果顯示，高劑量木補可顯著提高心肌缺血大鼠Omentin－1分泌量、iNOS蛋白表達量，提示彝藥木補可通過調節心肌缺血大鼠Omentin－1分泌水平，進而刺激心臟iNOS蛋白表達，從而增加血液中NO的釋放量，清除超氧陰離子和過氧自由基，抑制NADPH氧化酶活性，減少氧化損傷，以改善心肌缺血癥狀。

TGF－β1是一種由血管內皮細胞、心肌細胞等分泌的具有廣泛生物學功能的生長因子，是調節細胞增殖、凋亡的重要因素［8］，它可能與心肌缺血等心血管疾病的發生發展有關。TGF－β1活化后可與細胞膜表面的二聚體受體結合，激活ⅳ型受體，磷酸化R－Smads分子C末端的絲氨酸殘基，傳導胞外信號，持續激活體內JNK活性，從而調控若干下游靶分子，不斷擴大信號級聯反應，促進心肌缺血損傷［9］。進一步對 TGF－β1介導的JNK1/2信號通路是否參與心肌缺血損傷進行探討，研究［10］表明，TGF－β1水平與心肌缺血等冠狀動脈疾病有關，可作為預測心肌缺血的重要臨床指標。同時Strand等［11］發現，體內JNK1/2的磷酸化對 TGF－β1的分泌具有正調控作用。本實驗結果顯示，彝藥木補預處理大鼠后，血漿TGF－β1分泌水平和體內JNK1/2的磷酸化程度均顯著降低，并呈現劑量依賴性，表明彝藥木補可通過抑制JNK1/2的磷酸化調節TGF－β1的分泌量，從而改善心肌缺血癥狀。

綜上所述，Pit介導的大鼠心電圖ST段抬高幅度的增加，可能與 Omentin－1和 TGF－β1的表達水平有關。彝藥木補可通過調節心肌缺血大鼠體內iNOS和JNK1/2蛋白活性，控制血清細胞因子的分泌，從而促進心肌缺血轉歸，但對彝藥木補改善心肌缺血作用的具體機制仍需進一步研究。

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［5］蔣娜，匡希斌.急性ST段抬高心肌梗死患者再灌注損傷性心電圖改變與炎癥及氧化應激的關系［J］.中南醫學科學雜志，2014，42（2）：157－160.

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