C35對胃癌細胞侵襲性的影響*

詹遠京，牛立志，徐克成，穆峰，施娟娟

（廣州復大腫瘤醫院腫瘤科，廣東 廣州 510305）

·論著·

C35對胃癌細胞侵襲性的影響*

詹遠京，牛立志，徐克成，穆峰，施娟娟

（廣州復大腫瘤醫院腫瘤科，廣東 廣州 510305）

目的了解C35基因在胃癌細胞株中的表達水平，探討C35基因在胃癌發生發展中的作用。方法培養人胃癌細胞株SGC-7901、BGC-823、HGC-27及正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1，以實時定量PCR檢測胃癌細胞株及正常胃黏膜細胞株中C35的表達水平；使用小片斷干擾RNA（siRNA）下調胃癌細胞株C35的表達；實時定量PCR及免疫印跡檢測干擾前后C35 mRNA及蛋白質表達的變化；MTT法和體外Matrigel侵襲實驗觀察C35減敲后胃癌細胞株生長能力和侵襲能力的改變。結果C35在胃癌細胞株中呈高表達，而在正常胃黏膜細胞中不表達；經C35特異的siRNA作用后，C35 mRNA及蛋白質表達明顯下降；減敲C35后，胃癌細胞株的生長能力和侵襲能力顯著降低。結論C35在胃癌細胞株中特異性高表達，C35在胃癌的發生發展中起促進作用。

C35；胃癌；基因干擾

2006年，EVANS等[1]通過扣除雜交技術，發現一種在乳腺癌細胞中普遍存在且特異性高表達，而在正常乳腺組織中不表達的新基因C35。C35基因位于人染色體17q12，在Her-2/neu的擴增子上，位于Her-2/neu和GRB7之間，編碼12 kDa的膜固定蛋白。通過免疫組織化學研究發現，60%以上的乳腺癌患者可檢測到C35基因在所有癌癥發展階段均存在穩定的過表達現象。DASGUPTA等[2]研究發現，C35蛋白在前列腺癌細胞中可促進癌細胞的遷移和浸潤。

胃癌缺乏理想的腫瘤標志基因和分子靶向藥物。本研究以人胃癌細胞株SGC-7901、BGC-823及HGC-27為實驗組，以正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1作為對照，比較胃癌細胞株與正常胃黏膜細胞株之間C35的表達差異，初步探討C35基因在胃癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

SGC-7901、BGC-823、HGC-27購自中國科學院上海細胞庫，GES-1購自上海消化系疾病研究所，RPMI 1640培養基購自GibcoTM公司，標準胎牛血清購自杭州四季青公司，0.25%胰蛋白酶購自Amresco公司，C35特異性siRNA、羊抗人C35抗體、辣根過氧化物酶標記的驢抗羊二抗抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，Trizol試劑盒、脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000及逆轉錄試劑盒購自Invitrogen公司，Real time聚合酶鏈反應擴增試劑盒購自美國Gene Copoeia公司，噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑盒購自碧云天生物技術研究所，Transwells小室購自COSTAR公司，基底膜基質Matrigel購自Beeton Dickinson公司。

1.2細胞培養

將細胞株置于10 ml含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，在37℃、5%二氧化碳CO2、95%濕度的培養箱中貼壁生長。約3～5 d換液，待細胞長滿培養瓶底75%面積時，用0.25%胰酶消化傳代。

1.3實時定量PCR

按Trizol說明書中步驟提取各實驗細胞株的總RNA，取RNA 1μg按說明書方法逆轉錄成cDNA用于后續PCR反應。用ABI 7500熒光定量PCR儀和SYBR Green I染料混合物進行PCR反應，反應條件為：93℃預變性1 min，40個循環93℃變性30 s、55℃退火45 s，72℃延伸30 s，然后從72～95℃建立熔解曲線。以ABI 7500 Software v2.0.6讀取PCR反應結果。C35為目的基因，正向引物序列：5'-GAGATAAATGGACAGCTGGTGTTCT-3'；反向引物序列：5'-CGGCTGTTGGTGATCTTTTCTA-3'。以GAPDH為內參，正向引物序列：5'-CCTGCACCACC AACTGCTTAG-3'；反向引物序列：5'-CAGTCTTCTG GGTGGCAGTGA-3'。實時定量PCR結果以Ct值表示，△Ct為同一樣本中內參與目的基因Ct值之差，采用2-△△Ct相對定量分析方法比較目的基因在實驗和對照樣品間的表達差異。

1.4siRNA轉染

轉染前1天將1.0×105對數期生長的細胞接種于24孔培養板中，每孔加入0.5 ml的培養基，以10μmol/L濃度的siRNA進行基因干擾實驗。第2天按照LipofectamineTM2000說明書的常規方法配制轉染試劑，每孔使用DNA 0.8μg、轉染試劑2.0μl，轉染3～5 h后換液，繼續培養24 h后收集樣本，通過實時定量RT-PCR方法檢測C35基因的mRNA表達水平。

1.5Western blot

采用化學發光（ECL法）技術進行C35蛋白檢測。收集各組細胞后超聲破碎，取適量進行12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；羊抗人C35抗體作為一抗，GAPDH作為對照。

1.6MTT實驗

收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，鋪板使細胞密度調至103～104個/孔。5%二氧化碳CO2，37℃條件下孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）。轉染siRNA后孵育48 h進行MTT檢測。

1.7細胞體外浸潤實驗

取300μl無血清培養基，加入60μl Matrigel混勻，加入上室各100μl（3個室），37℃孵育5 h使其呈凝膠狀；上室加入無血清培養基稀釋的細胞100μl，下室內加入完全培養基500μl；放入細胞培養箱，在37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養24 h；取出小室，吸棄上室液體，用棉簽仔細擦凈膜上未侵襲的細胞以及人工基底膠膜，PBS洗2遍，5%戊二醛固定，加入結晶紫染色；顯微鏡下計數浸潤到小室背面的細胞，200倍光鏡隨機選擇5個視野計數，取平均值。

1.8統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析，數據以均數±標準差（x±s）表示，兩組間均數比較用t檢驗，兩組以上均數比較用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1胃癌細胞株中C35的表達

實時定量PCR檢測C35基因在3株胃癌細胞株和正常胃黏膜細胞株中mRNA表達水平。熔解曲線具有單峰特異性，正常胃黏膜細胞株GES-1中未檢出C35基因，HGC-27和BGC-823中C35的表達分別是SGC-7901的1.47倍和1.58倍。Western blot檢測C35蛋白在4種細胞株中的表達，3種胃癌細胞株均表達，GES-1無明顯表達。見圖1。

圖1 C35在GES-1、HGC-27、BGC-823和SGC-7901細胞株中的表達

2.2siRNA轉染后C35的表達

與陰性對照組比較，實時定量PCR結果顯示24 h后HGC-27、BGC-823和SGC-7901細胞株中目的基因C35的抑制效率分別為：84.40%、89.20%和93.34%。與空白對照比較，HGC-27、BGC-823及SGC-7901中C35的表達水平分別是：0.007480、0.010315和0.004432。ECL方法顯示siRNA轉染24 h后C35的蛋白表達明顯受抑制。見圖2和3。

圖2 siRNA基因減敲后C35在GES-1和HGC-27的表達

圖3 siRNA基因減敲后C35在BGC-823和SGC-7901的表達

2.3siRNA轉染后胃癌細胞株的增殖水平

MTT檢測顯示，siRNA轉染48 h后，胃癌細胞株HGC-27、BGC-823和SGC-7901在酶標儀490 nm處測量吸光光度值分別為：（0.325±0.011）、（0.235±0.019）和（0.330±0.034），方差分析結果顯示每種胃癌細胞株siRNA干擾組、未受干擾組、陰性對照組之間差異有統計學意義（均P＜0.001），LSD法結果顯示3種胃癌細胞株siRNA干擾組吸光光度值均顯著小于其他兩組（均P＜0.001），siRNA轉染后胃癌細胞株的增殖能力明顯降低。見圖4。

圖4 siRNA基因減敲后細胞株的增殖水平

2.4siRNA轉染后胃癌細胞株的侵襲能力

HGC-27細胞株siRNA轉染組細胞穿過人工基底膜的平均細胞數為（13.0±2.3）個，顯著少于陰性對照組（53.0±7.8）個（t檢驗，P＜0.001）及空白對照組的（58.0±10.7）個（P＜0.001）；BGC-823細胞株siRNA轉染組細胞穿過人工基底膜的平均細胞數為（5.0±1.8）個，顯著少于陰性對照組（45.0±8.1）個（P＜0.001）及空白對照組的（49.0±7.3）個（P＜0.001）；SGC-7901細胞株siRNA轉染組細胞穿過人工基底膜的平均細胞數為（5.0±2.0）個，顯著少于陰性對照組（13.0±2.6）個（P＜0.001）及空白對照組的（15.0± 2.7）個（P＜0.001）。

3 討論

以往研究證實[3-4]，20%～40%乳腺癌患者存在Her-2/neu過度表達。有研究通過免疫組織化學研究發現，60%以上的乳腺癌患者可檢測到C35基因在所有癌癥發展階段均存在穩定的過表達現象，表達量和穩定性均明顯高于Her-2/neu基因。所有Her-2/ neu基因高表達的病例均有C35基因高表達，但尚未檢測到Her-2/neu基因表達陽性而C35基因表達陰性的乳腺癌病例，表明C35基因在乳腺癌細胞的過表達更常見、范圍更廣，其功能可能與乳腺癌的發生、發展關系更為密切。巴再華等[5]研究發現隨著乳腺癌組織的TNM分期、病理組織學分級的增加，C35蛋白陽性率顯著升高。C35被認為是一種新型乳腺癌標志基因，尤其適用于乳腺癌早期階段的預測和診療。

胃癌中也存在Her-2/neu的過度表達。采用單克隆抗體的ICH法檢測Her-2/neu表達的研究表明，胃癌中Her-2/neu的過表達率為6%～45%，BANG等[6]在大樣本量的一個研究（3 883例胃癌患者）中得到Her-2/neu的過表達率為22.9%。胃癌的基礎和臨床研究顯示，Her-2/neu在部分胃癌患者中過表達，是一個預后不良因素，曲妥珠單抗作為針對Her-2/neu的分子靶向藥物，將其聯合化療可改善總生存率，取得了較好的療效[7]。通過靶向藥物抑制Her-2/neu基因過度表達來治療胃癌的局限性在于：Her-2/neu過表達在胃癌患者中所占比例有限，且即使是Her-2/neu過表達患者，仍有超過50%患者未獲治療反應[8]。

本研究以胃癌細胞HGC-27、BGC-823、SGC-7901及正常胃黏膜細胞GES-1為對象，結果表明C35在分化程度不同的胃癌細胞株中均呈高表達水平，而在正常胃黏膜細胞中不表達，初步證實C35可能是理想的胃癌細胞診斷的標志分子。將C35特異的siRNA經脂質體轉染至胃癌細胞后，C35的抑制率較高蛋白表達明顯受抑制，癌細胞的侵襲能力顯著下降，表明C35可成為理想的胃癌治療靶基因。

C35蛋白的致癌性與ITAM motif（一種在逆轉錄病毒中發現的結構域）[9]存在直接關聯。KATZ等[10]發現，C35基因在正常細胞中處于失活狀態，過表達后會通過上皮細胞轉化為間葉細胞的細胞轉化過程，下調上皮細胞標志基因E-cadherin和keratin-8的表達，細胞形態趨向紡錘型，最終導致細胞癌變。HSU等[11]通過研究C35蛋白的空間結構，提出C35可能依靠具有氧化還原活性的超二級結構而在AKT磷酸化過程中發揮重要的調節作用。隨著機制研究的不斷深入和靶向藥物的加速研發，相信C35會為胃癌的診斷與治療產生巨大推動作用。

[1]EVANS EE,HENN A D,JONASON A,et al.C35(C17orf37)is a novel tumor biomarker abundantly expressed in breast cancer [J].Mol Cancer Ther,2006,5(11):2919-2930.

[2]DASGUPTA S,WASSON LM,RAUNIYAR N,et al.Novel gene C17 or f37 in 17q12 amplicon promotes migration and invasion of prostate cancer cells[J].Oncogene,2009,28(32):2860-2872.

[3]KAUFMANN M,VON MINCKWITZ G,BEAR HD,et al.Recommendations from an international expert panel on the use of neoadjuvant(primary)systemic treatment of operable breast cancer:newper-spectives2006[J].AnnOncol,2007,18(12): 1927-1934.

[4]WOLFF AC,HAMMOND ME,SCHWARTZ JN,et al.American SocietyofClinicalOncology/CollegeofAmericanPathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer[J].J Clin Oncol,2007,131(1): 18-43.

[5]巴再華,朱嵩,徐超,等.C35蛋白在乳腺癌組織中的表達及臨床意義[J].中國病原生物學雜志,2013,8(6):551-555.

[6]BANG Y,CHUNG H,XU J,et al.Pathological features of advanced gastric cancer(GC):relationship to human epidermal growth factor receptor2(HER2)positivity in the global screening programme of the ToGA trial[J].Journal of Clinical Oncology, 2009,27(15S):4556.

[7]NICHOLAS G,CRIPPS C,AU HJ,et al.Early results of a trial oftrastuzumab,cisplatinanddocetaxelforthetreatmentof metastatic gastric cancer overexpressing HER2[C].Istanbul:ESMO,2006.

[8]VALABREGA G,MONTEMURRO F,AGLIETTA M.Trastuzumab:mechanism of action,resistance and future perspectives in HER2-overexpressing breast cancer[J].Ann Oncol,2007,18(6): 977-984.

[9]UNDERHILL D M,GOOD RIDGE HS.The many faces of ITAMs [J].Trends Immunol,2007,28(2):66-73.

[10]KATZ E,DUBOIS-MARSHALL S,SIMS AH,et al.A gene on the HER2 amplicon,C35,is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of syk[J].British Journal of Cancer,2010,103(3):401-410.

[11]HSU CH,SHEN TL,CHANG CF,et al.Solution structure of the oncogenic MIEN1 protein reveals a thioredoxin-like fold with a redox-active motif[J].PLoS One,2012,7(12):e52292.

（張立芳 編輯）

Effect of C35 on invasion of gastric cancer cell lines*

Yuan-jing ZHAN,Li-zhi NIU,Ke-cheng XU,Feng MU,Juan-juan SHI
(Department of Oncology,Fuda Cancer Hospital at Guangzhou, Guangzhou,Guangdong 510305,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of C35 in gastric cancer cell lines,and the effect of C35 on carcinogenesis and development of gastric cancer.【Methods】Human gastric cancer cell lines,including SGC-7901,BGC-823,HGC-27,and human gastric epithelial cell line GES-1,were cultured.The expression of C35 in gastric cancer cells and human gastric epithelial cells were detected by real-time PCR.We perturbed C35 gene expression using short interfering RNA molecules(siRNAs)and then investigated the changes of C35 gene expression before and after the interference using Western blots and RT-PCR.The proliferative and invasive abilities were detected by MTT colorimetry and Matrigel invasion assays.【Results】C35 was positively expressed in gastric cancer cell lines,while negatively expressed in normal gastric epithelial cells.After gene transfection,the expression level of C35 decreased notably.The proliferative and invasive abilities were obviously inhibited in gastric cancer cells in which C35 gene had been"knocked out".【Conclusion】C35 can over express in human gastric cancer cell lines and enhance the growth ability of gastric cancer cells.

C35;gastric cancer;RNA interference

R735.7

A

1005-8982（2015）25-0008-04

2015-01-18

中國科學院再生生物學重點實驗室開放課題（No：KLRB201219）