1例大劑量甲氨蝶呤治療骨肉瘤的藥代動力學監護

朱婷婷，趙宇蕾，齊謝敏，芮建中，周國華

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一種抗代謝類抗腫瘤藥，屬細胞周期特異性藥物，主要作用于S期。MTX亦為葉酸拮抗劑，可與二氫葉酸還原酶(DHFR)的催化部位結合，由于其親和力很高，可用于抑制DHFR活性，阻止DHFR將二氫葉酸還原為四氫葉酸，使一碳單位轉移過程受到抑制，脫氧尿苷酸不能變為合成DNA所必需的脫氧胸苷酸，嘌呤核苷酸合成的早期階段也受抑制，使DNA及RNA合成均受阻。高濃度的MTX還可抑制葉酸進入細胞，并促進還原的葉酸外流，使腫瘤細胞內葉酸多聚谷氨酸池顯著縮小，競爭性地減少腫瘤細胞內的葉酸供應。此外，MTX也可抑制胸腺核苷酸合成酶，抑制體液免疫和細胞免疫。大劑量MTX對多種惡性腫瘤療效顯著，如急性淋巴細胞白血病、骨肉瘤［1］、惡性淋巴瘤、頭頸部惡性腫瘤、非霍奇金淋巴瘤等。但MTX選擇性差，會帶來嚴重不良反應，經大劑量MTX化療后嚴重毒性反應的發生率可達10%以上［2］，不同患者或同一患者的不同輪次治療時MTX血藥濃度亦存在較大差異，根據血藥濃度監測結果制定個體化治療方案，既可最大限度地避免化療產生的不良反應，也能保證抗腫瘤的治療作用，降低復發率。

我院1例骨肉瘤經大劑量MTX化療后出現血藥濃度異常，通過及時的血藥濃度測定和藥代動力學監護，為臨床救治提供了有效的技術支持，使患者恢復正常，現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 患者男，15歲，未婚，身高180 cm，體重75 kg，體質指數23.1 kg/m2。于外院行 MRI示:左股骨遠端干骺端骨腫瘤。2014年2月24日在我院聯合腰麻下行“左股骨遠端骨肉瘤切開活檢術”，病理檢查示“左股骨遠端骨肉瘤”，高度侵襲性，腫瘤細胞侵犯骨外軟組織。4月7日因左股骨遠端病理性骨折在同濟醫院行左大腿上段截肢術，術后恢復良好。

1.2 治療過程 患者于4月22日第三次入我院，體重63 kg，體質指數19.4 kg/m2，肝腎功能正常。4月23日行MTX注射劑(MTX 10 g溶于0.9%氯化鈉500 mL內靜脈滴注6 h)化療，并輔以長期甲酰四氫葉酸鈣(calcium folinate，CF)注射劑(25 mg/100 mL，4次/d，靜脈滴注)解毒，碳酸氫鈉注射劑(250 mL/d，靜脈滴注)堿化尿液，使入液量＞4000 mL，并囑其多飲水，使其尿量＞3000 mL，尿pH值≥6.5。同時采用復方甘草單銨 S注射劑(0.32 g，1次/d，靜脈滴注)保肝;核糖核酸注射劑、脫氧核苷酸鈉注射劑、磷酸肌酸鈉注射劑、復方三維B注射劑、能量合劑注射劑、門冬氨酸鳥氨酸注射劑、門冬酸鉀鎂注射劑、混合糖電解質注射劑、轉化糖注射劑等維持營養、電解質平衡;雷莫司瓊注射劑等用于止吐;托拉塞米注射劑、甘露聚糖肽注射劑、果糖注射劑用于利尿和改善微循環;小牛脾提取物注射劑提高機體免疫力;泮托拉唑注射劑(80 mg，1次/d，靜脈滴注)抗酸抗潰瘍。

1.3 檢測儀器與試劑 MTX血藥濃度監測儀(Syva Viva－E德國西門子公司)，甲氨蝶呤試劑盒(德國西門子公司)。PCR擴增儀(A200 Grodient Thermal cycler中國 LongGene公司)，焦磷酸測序儀(Pyro－Mark Q24 MDx德國QIAGEN公司)，DNA提取試劑盒(美國Promega公司)，焦磷酸測序試劑盒(德國QIAGEN公司)。藥代動力學參數擬合使用BAPP 3.1軟件自動擬合處理，計算藥代動力學參數。

1.4 方法 靜脈滴注10 g MTX后采取靜脈血檢測24、48、72 h的MTX血藥濃度。以PCR法檢測亞甲基四氧葉酸還原酶(MTHFR)677C＞T基因型。留取外周全血樣本2 mL，按DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA。實驗用DNA模板均以紫外分光光度法測定其濃度及純度。PCR反應體系包括 PCR－mix 43.5 μL［T－mix 12 μL(10 × PCR 緩沖液∶MgCl2∶dNTP Mixture=5∶3∶4)，蒸餾水 31.25 μL，rTaq 0.25μL］，引物(正反向)4 μL，引物(上海 Invitrogen公司合成)序列:上游引物:5’－GACTGTCATCCCTATTGGCAGGTT－3’，下游引物:5’－Biotin－CCCTCACCTGGATGGGAAAGA－3’。PCR 擴增反應條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環后72℃再延伸10 min。取20 μL PCR產物加入 Binding Mix 60 μL(Sepharose Beads 2 μL，蒸餾水 18 μL，Binding Buffer 40 μL)，PyroMark Wash Buffer 24 μL，Denaturation Solution 1 μ，制備測序單鏈，加入測序引物退火，制備測序模板，測序引物序列:5’－GAGAAGGTGTCTGCGGGAG－3’。按焦磷酸測序試劑盒說明書操作進行測序，測序引物后序列:5’－C/T CGATTT－3’［3］。

2 結果

2.1 患者 MTX血藥濃度－時間曲線 滴注10 g MTX后持續監測該患者測得24、48、72 h點血藥濃度分 別 為 180.0 μmol/L、57.0 μmol/L、20.4 μmol/L，給藥后18 d內MTX血藥濃度－時間曲線見圖1。

圖1 MTX血藥濃度－時間曲線圖

2.2 藥代動力學參數 該患者滴注用藥后各時間點的血藥濃度數據經BAPP 3.1自動擬合后，藥物在體內動力學過程符合二室模型特征，藥代動力學參數結果見表1。

表1 患者10 g MTX滴注后藥代動力學參數

2.3 MTHFR 677C＞T基因型 本例患者的MTHFR 677C＞T基因型為突變型(677TT)。

2.4 不良反應及監護 4月27日、28日患者出現嘔吐、腹脹反應，29日出現厭食、惡心反應，精神、食欲較差，口腔潰瘍嚴重，給予復方洗必泰漱口液(200 mL，漱口)、西瓜霜噴劑(2.5 g，外用)治療。4月29日，丙氨酸氨基轉移酶259 U/L↑，尿素12.4 mmol/L↑，肌酐254 μmol/L↑。5月3日，血小板計數93×109/L↓、白細胞計數1.5×109/L↓，紅細胞計數3.06×1012/L↓。5月6日，血小板計數22×109/L↓、白細胞計數2.4×109/L↓，紅細胞計數3.76×1012/L↓，予以粒細胞刺激因子注射劑(200 g，皮下注射，2次/d)提升白細胞，重組人白介素－11注射劑(1.5 mg，皮下注射，1次/d)提高血小板。5月8日，單采血小板1治療量，輕微過敏，靜推5 mg地塞米松。5月11日，血小板計數252×109/L，白細胞計數17.2 ×109/L↑，紅細胞計數3.36 ×1012/L↓;肝腎功能無異常，血清MTX(即用藥后第18天)濃度為 0.15 μmol/L，CF解救停止。患者申請出院，囑患者注意休息，加強營養，定期化療。

3 討論

目前臨床較認同大劑量MTX化療后中毒血藥濃度即過量毒性反應上限為給藥后24 h＞10 μmol/L、48 h ＞1 μmol/L、72 h ＞ 0.1 μmol/L。本例患兒出現嚴重排泄延遲，用藥后72 h的MTX濃度為 20.4 μmol/L，t1/2β長達 58.8 h，藥師建議臨床醫生延長解救方案執行時間，并持續為患者進行血藥濃度監測，跟蹤血藥濃度變化情況，用藥后第18天MTX血藥濃度達到臨床安全值(0.15 μmol/L)。

患者原計劃行吡柔比星、順鉑、異環磷酰胺、甲氨蝶呤的交替化療［4－5］。然而，MTX 化療后血藥濃度持續偏高，代謝緩慢，排泄延遲，肝腎功能受損，改行吡柔比星、順鉑、異環磷酰胺化療交替進行，停用MTX，避免MTX造成嚴重的毒性損害。

MTHFR是葉酸代謝途徑的關鍵酶，國內外研究MTX在人體內的代謝與MTHFR基因多態性的關系［6］，報道結果不一致，孟琳懿等［7］研究認 為677CC型患兒可能出現更嚴重的藥物毒性反應，說明攜帶677CC基因型的患兒對HD－MTX化療更敏感，但有報道與孟琳懿的結果相反，李天媛等［8］認為突變型(677CT/TT)個體的MTX血藥濃度高、毒性反應更大。導致MTX排泄延遲的危險因素有MTX用量、開始化療后24 h內尿常規pH值、個體基因型、肝腎功能等［9］。本例患者15歲，截肢術后體質指數明顯降低，MTHFR 677C＞T基因型為突變型(TT)，而合用泮托拉唑注射劑(80 mg，1次/d，靜滴)，也可能增加血液中MTX濃度，增加不良反應風險［10－11］。

水化、尿液堿化和葉酸解救等手段極大地降低了患者死亡率，但是HD－MTX導致的腎功能損害仍是嚴重問題，通過監測MTX血藥濃度并根據測定結果調整CF用量和次數已成臨床專家共識，近年來也有學者試圖從血液學、免疫學、常規生化的檢驗來預判MTX蓄積中毒性事件，以制定合理有效的救援方案，但發現影響因素多且不確定，目前無法定論。眾多研究認為，以48 h點血藥濃度對預測后期消除較為敏感，國內多數兒童治療中心多以48 h MTX血藥濃度是否＞1 μmol/L來判斷排泄延遲或消除異常。患兒接受MTX后，對解救適宜與否直接關系療效與預后，若不能及時有效地進行救援易發生黏膜損傷、急性肝腎功損傷甚至衰竭、嚴重神經系統毒性等，但救援過度則會影響化療效果甚至加重原疾病復發。患者對MTX的耐受程度、重要臟器功能(尤其是腎功能)以及病理分期等均影響MTX在體內的吸收、分布、代謝和排泄［12］，因而準確的藥代動力學監測，及時發現患者的嚴重不良反應，對找出合理的MTX用量及CF解救時間、劑量，可及時為醫生合理用藥提供參考，為實現患者個體化給藥提供重要依據［13］。

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