鎘脅迫下泡菜乳酸乳球菌的形態變化

連元元，王 穎，李 晨，谷新晰，盛 耀，黃昆侖,*，田洪濤,*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 1000 83）

鎘脅迫下泡菜乳酸乳球菌的形態變化

連元元1，王 穎2，李 晨1，谷新晰1，盛 耀2，黃昆侖2,*，田洪濤1,*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 1000 83）

通過掃描電鏡和透射電鏡分別觀察不同質量濃 度水平的Cd2+對泡菜乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. lactis）細胞的影響，掃描電鏡結果顯示：Cd2+質量濃度在0、10 mg/L時，泡菜乳酸乳球菌呈橢圓形、表面光滑、菌體生長繁殖旺盛，隨著Cd2+質量濃度的增加菌體細胞表面產生白色顆粒狀物質、菌體細胞存活數量大幅下降（OD600nm值由1.336下降到0.515）。當添加200 mg/L Cd2+時，幾乎沒有見到明顯的菌體、顯示有少量棱形晶狀物。透射電鏡結果顯示：當Cd2+質量濃度為0～50 mg/L時泡菜乳酸乳球菌結構完整、細胞內容物分布均、菌體生長較為正常，當菌體暴露于100、200 mg/L Cd2+時菌體細胞出現異常現象，如細胞破裂、內容物從薄膜穿孔中釋放、質壁分離等。兩類電鏡結果均表明：在低質量濃度Cd2+（≤50 mg/L）脅迫下，對泡菜乳酸乳球菌的生長幾乎不產生影響，添加Cd2+質量濃度上升到100、200 mg/L時泡菜乳酸乳球菌正常生長受到抑制。

乳酸乳球菌；鎘脅迫；電鏡；亞細胞結構

鎘是一種過渡金屬，是對生物有機體最具威脅的重金屬元素之一。目前我國糧食作物鎘污染情況大致如下：1980年中國農業環境報告，我國農田土壤鎘污染面積為9 333 hm2，隨后有人提出鎘污染面積為13 333 hm2（根據GB 15618—1995《土壤環境質量標準》土壤中鎘的限量標準是0.006 mol/kg）；最近據不完全統計，我國受鎘污染的農田面積達到2.8×105hm2，每年生產的鎘含量超標的農產品達1.46×1010kg（我國GB 2762—2012《食品中污染物限量》規定大米中鎘限量標準是0.2 mg/kg），使得鎘污染嚴重威脅著農業生態環境、人類健康安全。生物吸附法是最近發展較快較先進的去除重金屬方法，生物吸附法與傳統方法相比具有如下優點：原料來源豐富，品種多；設備簡單，運行費用低；吸附量大，處理效率高； pH值和溫度條件范圍寬。

目前鎘暴露產生了嚴重的健康危害，而且鎘在膳食來源中的暴露不斷增加，但沒有可行的方法去除食品和飼料中的鎘。對于食品重金屬的去除，除了釀酒酵母屬于食品微生物外，其他的食品微生物，例如食品益生菌研究甚少。而最近食品中公認的益生菌乳酸菌越來越受到關注，關于利用其去除食物中污染的重金屬離子在國內處于初步研究，但也顯示出了可行性和潛力[1]。

實驗選取鎘作為重金屬靶元素。實驗中的菌株是自行由泡菜中提取并保存的一株泡菜乳酸乳球菌。經實驗發現，其最高耐鎘質量濃度可達200 mg/L，由于其是食品中的益生菌（根據進化樹比較發現其同源性與Lactococcus lactis subsp. cremoris strain IMAU40012同源性上最近，而后者為中國益生菌網中可查到的一株益生菌），因此可用于去除食品中的鎘。有研究表明鎘對食用菌生長的影響不僅體現在生長速率上，還體現在不同程度地影響細胞膜結構和細胞器[2]。掃描電鏡和透射電鏡可以用來清晰地觀察微生物細胞表面和內部的結構以及細胞器。本實驗利用了這兩種電鏡方法探索討論了鎘添加后泡菜乳酸乳球菌菌體表面和亞細胞結構的變化，可以直觀地觀察到重金屬在其細胞表面和亞細胞器上的分布和毒性作用，從而推測重金屬的吸收途徑和可能參與的機體代謝，以便后續總結出其與鎘之間的相互作用機制，揭示其耐鎘分子機制，最后應用于食品中鎘污染的治理。同時為衡量此株泡菜乳酸乳球菌是否適應重金屬環境以及重金屬耐受性大小提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

來源：分離自含Cd2+的泡菜，保存在中國農業大學東校區金工樓。

1.2 試劑

2.5 %戊二醛（醫用）、25%戊二醛（醫用）溶液武漢市帝科化工有限公司；鋨酸 北京精華耀邦醫藥科技有限公司；磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2） 北京奧博來科技有限責任公司；0.2 mol/L磷酸氫二鈉貯備液、乙醇 北京化工廠；0.2 mol/L磷酸二氫鈉貯備液北京鵬彩精細化工有限公司；環氧丙烷 東營匯中化工有限公司；SPI812環氧樹脂 北京中興百瑞技術有限公司；以上試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

TM3000掃描電鏡、JEM-1230透射電鏡、JSM-6301F掃描電鏡、JEOL-2010F高分辨率透射電鏡 日本 Hitachi公司。

1.4 方法

將單菌落挑到新鮮的液體MRS培養基中進行活化，以1%接種量轉接到新鮮的MRS培養基中，在37 ℃條件下預培養6 h，添加Cd2+至終質量濃度10、50、100、200 mg/L，20 h后收集菌液，去離子水清洗3 遍，制備電鏡樣品。

1.4.1 掃描電鏡樣品前處理

取各實驗組菌體（未添加Cd2+和Cd2+添加培養菌體），蒸餾水洗滌5 次，以祛除菌體表面浮色，5%戊二醛固定，1%鋨酸再固定，乙醇梯度（30%、50%、70%、80%、90%、100%）脫水，乙酸異戊酯處理后，臨界點干燥噴金，實驗采用TM3000型掃描電鏡觀察菌體表面特征變化。

1.4.2 透射電鏡樣品前處理

取各實驗組菌體（未添加Cd2+和Cd2+添加培養菌體），清洗后立即放入福爾馬林的溶液中浸泡保存，環氧樹脂包埋，超薄切片后，采用JEM-1230型透射電鏡觀察富集前后菌體內部結構變化。

2 結果與分析

2.1 掃描電鏡結果

當培養基中Cd2+達到50 mg/L時菌體依舊大量存活，菌體表面附著有白色細小鹽狀晶體。圖1a顯示為分辨率1 μm時的菌體形態，有白色顆粒狀晶體以團狀存在，包裹在菌體細胞外。當培養基中添加的Cd2+達到100 mg/L時，菌體量較少，出現白色顆粒狀鹽沉淀。圖1b（分辨率為1 μm）中更明顯的顯示出白色凝集狀鹽結晶，可以觀察到背景中正分裂的菌體和一較長菌體，猜測可能與形成的細菌生物膜來黏附重金屬以適應環境壓力有關[3]。Aymerich[4]、Behr[5]和Kubota[6]等也發現乳酸菌在逆境環境中可以形成生物質。圖1c顯示為Cd2+200 mg/L處理時通過掃描電鏡觀察到的泡菜乳酸乳球菌形態，幾乎沒有見到明顯的菌體，顯示有少量棱形晶狀物，與形成結晶生物化石可能存在關聯。重金屬在微生物表面通過與螯合物形成沉淀或在細胞壁上與特殊結構如S-蛋白形成核中心，可促進生物礦石晶體生長。而且這種沉淀和生物礦石有時有重疊的現象，尚不清楚是哪個作用單獨或主要起到了固定重金屬的作用[7]。

2.2 透射電鏡結果

圖2 添加Cd2+泡菜乳酸乳球菌透射電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrographs of Lactococcus lactis subsp. lactis exposed to different concentrations of Cd2+

圖2a所示為未添加Cd2+，處于分裂期有完整細胞的泡菜乳酸乳球菌（透明部分為切片不當所致，與菌體形態無關）。圖2 b、2c所示為Cd2+在質量濃度10、50 mg/L時透射電鏡圖，菌體受Cd2+影響不大，多數為正常生長和處于分裂期的菌體細胞，細胞完整飽滿，內容物分布均勻致密，細胞壁薄。Cd2+質量濃度50 mg/L時有少量質壁分離現象，質壁分離處有氣泡或囊泡，可能和菌體自身隔離Cd2+采取的防御措施有關，是細胞內阻止胞質積累的重金屬對重要細胞器毒害的有效策略[8-10]，這在真核微生物如藻類、真菌、酵母中經常出現。真菌積累的大部分Co2+、Mn2+通常情況下存在于小氣泡中，并以離子的形式存在或結合于多聚磷酸鹽上或通過蛋白質發揮貯存、調節金屬離子濃度的作用，例如聚球菌屬（Synechococcus sp.）產生的金屬硫蛋白[11]。當Cd2+、Zn2+濃度較高時，聚球菌屬（Synechococcus sp.）的抗Cd、Zn基因smtA、smtB誘導表達，并且受smtB產物的抑制，smtA金屬硫蛋白半胱氨酸殘基可與過量的金屬陽離子產生沉淀[12-13]。

圖2d、2e是Cd2+質量濃度添加至100、200 mg/L時乳酸菌微觀透射顯微鏡圖，顯示有些菌還是正常現象。有些菌已經開始有異常或凋敝的現象。以上圖片可以呈現出乳酸菌體異常凋敝的動態過程。未添加Cd2+和低質量濃度Cd2+組別菌體橫切面為規則圓形，細胞壁規則致密，細胞膜完整，菌體飽滿，表面無黑色顆粒物，當Cd2+質量濃度高至100 mg/L時，菌體細胞壁質地疏松，厚度增大，出現氣泡、囊泡，表明菌體對Cd2+具有較高抗性；Cd2+質量濃度繼續升高至200 mg/L時，出現質壁分離，菌體細胞膜有明顯穿孔，有內容物釋放現象，猜測為胞內染色質和蛋白結構物。非必需金屬元素可取代結合位點的必需元素，與配基反應，產生毒害作用，導致核酸、蛋白質構象改變，干擾氧化磷酸化及滲透壓的平衡，從而導致菌體代謝失常和凋敝[14-15]。樊霆[16]在研究真菌CTB430對Cu和Zn抗性時比較菌體富集Cu和Zn前后菌體內部結構變化時也有類似損傷菌體真絲及細胞壁膜現象出現。

Cd2+質量濃度較低（50 mg/L以下）時菌體正常生長，質量濃度逐漸升高時有黑色電子密度顆粒、液泡等一些異常現象出現，體現了菌體自身防御機制在抗Cd2+毒性方面的作用，Cd2+質量濃度較高（200 mg/L）時出現質壁分離，細胞膜出現穿孔，內容物外泄等結果推測泡菜乳酸乳球菌可能具有通過氣泡或囊泡隔離Cd2+的作用。金屬離子進入細胞后，通過區域化作用（c ompartmentalization）分布在細胞內的不同部位，可將有毒金屬離子封閉（如進入液泡或線粒體）或與熱穩定蛋白結合，轉變成為低毒的形式，是更有效的解毒方式[17]。

3 結 論

掃描電子顯微鏡照片顯示，較低Cd2+質量濃度（10、50 mg/L）處理時，泡菜乳酸菌細胞長短徑及細胞分裂，表面完整性與對照組比對都沒有出現明顯改變，這說明較低Cd2+質量濃度對于菌體影響不大；加大Cd2+質量濃度（100、200 mg/L）時，存活的菌體細胞量很少，有大量白色顆粒晶體鹽以及菱形狀巖石出現，這可能是鎘的各種沉淀形式（后續實驗通過掃描電鏡與X射線譜圖聯用，發現Cd2+質量濃度100、200 mg/L時晶狀體的主要元素是分別是C、O、Na、Cd和C、O、Cd）。

透射電子顯微鏡掃描結果顯示，未添加Cd2+菌和較低Cd2+質量濃度（10、50 mg/L）時泡菜乳酸菌細胞完整度較好，內容物分布較充實；當Cd2+質量濃度升至100、200 mg/L時菌體細胞破裂穿孔較普遍，內容物大量釋放在胞外環境中，內部有黑色電子密度顆粒堆積，質壁分離，細胞周質出現含有黑色電子密度顆粒的氣泡或囊泡，推測是Cd的絡合物。

低質量濃度Cd2+（10、50 mg/L）條件下，泡菜乳酸菌能較正常生長代謝，高質量濃度Cd2+（100、200 mg/L）時，泡菜乳酸乳球菌受Cd2+影響較大出現不正常的衰敗，死亡。在泡菜乳酸菌細胞表面有鎘沉淀，內部有鎘的絡合物，這與菌體自身的耐鎘機制有關。具體的耐鎘機制后續會進一步研究，可通過雙向電泳尋找差異蛋白，之后進行質譜鑒定，根據鑒定結果進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應實驗，確定關鍵耐鎘基因，即最終確定耐鎘的分子機制。

[1] 江南大學. 一種具有排鎘功能的植物乳桿菌及其用途: 中國, CN102827796 B[P/OL]. 2012-12-19[2013-10-30]. http://www.google. co.uk/patents/CN102827796B?cl=zh&hl=zh-CN.

[2] 黃敏敏, 江枝和, 翁伯琦, 等. 鎘對姬松茸菌絲體細胞超微結構的影響[J]. 熱帶作物學報, 2011, 32(6): 1082-1085.

[3] DONLAN R M. Biofilms: microbial life on surfaces[J]. Emerging Infectious Diseases, 2002, 8(9): 88l-890.

[4] AYMERICH T, MARTíN B, GARRIGA M, et al. Microbial quality and direct PCR identifi cation of lactic acid bacteria and nonpathogenic staphylococci fromartisanal low-acid sausages[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69: 4583-4594.

[5] BEHR J, G?NZLE G M G, VOGEL R F. Characterization of a highly hop-resistant Lactobacillus brevis strain lacking hop transport[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72: 648-649.

[6] KUBOTA H, SENDA S, NOMURA N, et al. Biofilm formationby lactic acid bacteria and resistance to environmental stress[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008, 106: 381-386.

[7] GLASAUER S, LANGLEY S, BEVERIDGE T J. Sorption of Fe(hydr)oxides to the surface of Shewanella putrefaciens: cell-bound fi ne-grained minerals are not a lways formed de novo[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67: 5544-5550.

[8] COBBETT C, GOLDSBROUGH P. Phytochelatins and metallothionei roles in heavy meta l detoxifi cation and homeostasis[J]. Annual Review of Plant Biology, 2002, 53: 159-182.

[9] CLEMENS S. Evolution and function of phytochelatin synthases[J]. Journal of Plant Physiology, 2006, 163(3): 319-332.

[10] CAI Yong, SU Jinhui, LENA Q Ma, Low molecular weight thiols in arsenic hyperaccumulator Pteris vittata upon exposure to arsenic and other trace elements[J]. Environmental Pollution, 2004, 129: 69-78.

[11] MARTIN S, RENE K, VACEK J, et al. Electrochemical study of heavymetals and metallothionein in yeast Yarrowia lipolytica[J]. Bioelectrochemistry, 2003, 60: 29-36.

[12] 徐柳, 宋琴, 茆燦泉. 金屬結合蛋白(肽)與環境重金屬生物修復[J].生物工程雜志, 2004, 24(4): 39-43.

[13] COOK W J, KAR S R, TAYLOR K B, et al. Crystal structure of the cyanobacterial metallothionein repressor SmtB: a model for metalloregulatory proteins[J]. Journal of Plant Physiology, 1998, 275: 337-346.

[14] 滕應. 重金屬污染下紅壤微生物生態特征及生物學指標研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2003.

[15] BRUINS M R, KAPIL S, OEHME F W. Microbial resistance to metals in the environment[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2000, 45(3): 198-207.

[16] 樊霆. 真菌對重金屬的抗性機制及富集特性研究[D]. 長沙: 湖南大學, 2009.

[17] 王保軍, 楊惠芳. 微生物與重金屬的相互作用[J]. 重慶環境科學, 1996, 18(1): 35-39.

Morphological Change of Lactococcus lactis subsp. lactis under Cadmium Stress

LIAN Yuanyuan1, WANG Ying2, LI Chen1, GU Xinxi1, SHENG Yao2, HUANG Kunlun2,*, TIAN Hongtao1,*
(1. College of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China; 2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Using scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM), the effects of different levels of cadmium (Cd2+) on Lactococcus lactis subsp. lactis cells were examined. The SEM results showed that when the mass concentration of Cd2+was 0 and 10 mg/L, the bacterium displayed an oblong shape with smooth surface and grew vigorously. With increasing concentration of Cd2+, white granules appeared on the surface and the number of surviving cells began to fall (i.e., OD was reduced from 1.336 to 0.515). Under the stress of Cd2+at 200 mg/L, almost no visible bacteria were seen and a small amount of prismatic crystals app eared. The TEM results revealed that when the mass concentration of Cd2+was 0–50 mg/L, the cell structure of this strain was intact and the cellular contents were evenly distributed, and the strain grew normally. When exposed to 100 and 200 mg/L Cd2+, it began to change abnormally such as ruptured cells and release of cellular contents f rom holes in the cellular membrane. In addition, plasmolysis was observed. Together, these results indicated that Lactococcus lactis subsp. lactis was hardly affected by Cd2+at low concentrations (≤ 50 mg/L) but inhibited at high concentrations (100 and 200 mg/L).

Lactococcus lactis subsp. lactis; cadmium stress; electron microscope; subcellular structure

Q934.3

A

1002-6630（2015）01-0124-04

10.7506/spkx1002-6630-201501024

2014-01-26

國家自然科學基金主任基金項目（31140065）；河北省自然科學基金項目（C2012204099）

連元元（1986—），女，碩士研究生，研究方向為益生菌資源的開發與應用。E-mail：544408643@qq.com

*通信作者：黃昆侖（1968—），男，教授，博士，研究方向為轉基因產品食用安全評價與檢測、食品安全風險評估技術與檢測技術、食品生物技術。E-mail：hkl009@163.com

田洪濤（1963—），男，教授，博士，研究方向為益生菌資源的開發與應用，工業微生物技術。E-mail：tht631022@163.com