大豆錳超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表達

馬紅丹，張麗媛，趙邯鄲，徐丹丹，曲 靜，關淑艷,*，王丕武,*

（1.吉林農業大學生命科學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學農學院，吉林 長春 130118）

大豆錳超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表達

馬紅丹1，張麗媛1，趙邯鄲1，徐丹丹1，曲 靜2，關淑艷1,*，王丕武2,*

（1.吉林農業大學生命科學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學農學院，吉林 長春 130118）

為使大豆錳超氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase，MnSOD）在乳酸乳球菌中高效表達，將克隆的MnSOD基因開放閱讀框序列分別重組到質粒pNZ8149和經改造的質粒pNZS上，表達載體pNZ-SOD和分泌表達載體pNZS-SOD，將兩者分別以電穿孔法轉化乳酸乳球菌L. lactis NZ3900，經Elliker瓊脂板篩選、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、酶切鑒定正確后，獲得的兩重組菌株加入Nisin進行誘導表達，對L. lactis NZ3900/pNZ-SOD和L. lactis NZ3900/pNZS-SOD的表達產物進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和酶活性對比分析。結果顯示：L. lactis NZ3900/ pNZS-SOD菌株表達SOD總活性約是L. lactis NZ3900/pNZ-SOD菌株的1.6 倍，是L. lactis NZ3900/pNZ8149的13.5倍，且可將表達的約2/3的SOD分泌到胞外，表明經改造的乳酸菌分泌表達系統L. lactis NZ3900/pNZS能夠分泌表達SOD，并增強SOD的表達。

錳超氧化物歧化酶（MnSOD）；食品級分泌表達載體；乳酸乳球菌

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物體防御氧化損傷的重要酶類，對生物體生命活動具有重要意義。錳超氧化物歧化酶（MnSOD）是SOD的一種，已有研究表明MnSOD基因過量表達與多種腫瘤（如乳腺癌、肺癌、胃癌等）相關，被認為是一種新的抗癌基因，因而受到廣泛關注[1-4]。但MnSOD在生物體內表達量較低，獲取困難，而應用重組微生物發酵生產可解決這一難題。目前，多種來源的MnSOD基因已在不同微生物中成功克隆和表達[5-7]。

乳酸菌是公認的食品級安全微生物，在食品工業和生物制藥等諸多領域廣泛應用。在基因工程領域，已建立一系列基于乳酸菌的遺傳轉化系統，應用這些系統定向生產人類所需要的產品將成為熱點。乳酸菌遺傳轉化系統中應用較多的是NICE系統，L. lactis NZ3900/ pNZ8149是NICE系統中的一種，其誘導劑、篩選標記和宿主均為食品級，符合美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）安全標準，是食品級安全的外源基因表達系統[8]，已有來源于動物、植物、微生物的不同外源基因在該系統中成功表達[9-11]。但外源基因在該系統中為胞內表達，可能存在外源基因產物在細胞內大量表達積累容易形成包涵體、產物容易被細胞內水解酶系統識別作為異源入侵物水解、獲得目的蛋白需要對菌體進行破碎處理等缺點，因此該系統在實際應用中具有一定局限性。

本實驗室已利用基因工程技術，對質粒pNZ8149進行改造，在其啟動子PnisA后插入乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白Usp45胞外分泌信號肽基因序列SPusp45，并利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術定點刪除啟動子與信號肽之間的酶切位點，獲得分泌表達載體pNZS，重新建立分泌表達系統L. lactis NZ3900/pNZS[12]，以打破該系統局限性。本實驗分別將大豆MnSOD基因導入L. lactis NZ3900/pNZ8149和L. lactis NZ3900/pNZS系統進行表達，嘗試對兩系統表達MnSOD基因的表達量和表達方式進行對比分析，為MnSOD的高效表達和直接應用研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質粒和菌種

L. lactis NZ3900和配套載體pNZ8149 荷蘭NIZO研究所；大腸桿菌DH5α和質粒pREP5N-MnSOD、經改造質粒pNZS 吉林農業大學植物生物技術中心[12]；克隆用質粒pMD18-T 大連寶生物公司。

1.1.2 引物

上游引物1：5′-GG ACT AGT ATG GCC GCG CGA GCT CTG T-3′；下游引物2：5′-TGC TCT AGA CTA AGA GCT CTC TTT CTC ATA C-3′；以下劃線標記的序列為引入的限制性酶切位點（SpeⅠ、XbaⅠ），引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。

1.1.3 試劑

pMD18-T克隆載體、質粒提取試劑盒、凝膠DNA回收試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶及DL2000Mark0er 日本TaKaRa公司；蛋白分子質量標準品（116、66.2、45、35、25、18.4、14.4 kD） 加拿大MBI公司；Nisin標準品 美國Sigma公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UNO PCR儀 德國Biometra公司；DYY-4型穩壓穩流電泳儀（配有DYY-33A型水平電泳槽、DYCZ-21型垂直電泳槽） 北京六一儀器廠；MicroPulserTM型電擊儀、Universal Hood S.N. 75s/01700凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成

根據GenBank已發表的大豆MnSOD基因（序列號AJ440726）的開放閱讀框序列及pNZ8149和pNZS載體序列，應用Premier5.0軟件設計一對特異性引物，并分別在上游引物和下游引物5′端引入限制性酶切位點SpeⅠ、XbaⅠ，引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。

1.3.2 MnSOD基因的克隆與鑒定

以含有MnSOD基因全序列的pREP5N-MnSOD為模板，以引物1、2擴增MnSOD開放閱讀框序列，產物以凝膠DNA回收試劑盒回收后，克隆到pMD18-T上，CaCl2法轉化E.coli DH5α感受態細胞。藍白斑篩選陽性轉化子，試劑盒提質粒，經PCR驗證，SpeⅠ、XbaⅠ雙酶切驗證，送北京三博遠志生物技術有限責任公司測序。

1.3.3 食品級載體的構建及乳酸菌轉化

測序正確的轉化子，試劑盒提質粒，以SpeⅠ、XbaⅠ雙酶切，凝膠回收目的片段后分別與同樣經雙酶切回收的pNZ8149和pNZS質粒以T4連接酶連接12 h，連接產物以電穿孔法轉化L. lactis NZ3900感受態細胞[13]，Elliker瓊脂板篩選陽性菌落[14]。挑取陽性菌落提質粒進行PCR及SpeⅠ，XbaⅠ雙酶切鑒定。鑒定正確的兩重組質粒送北京三博遠志生物技術有限責任公司測序，測序正確的表達載體命名為pNZ-SOD，分泌表達載體命名為pNZS-SOD。

1.3.4 SOD的誘導表達和乳酸乳球菌上清和菌體蛋白樣品的制備

L. lactis NZ3900/pNZ8149、L. lactis NZ3900/pNZSOD和L. lactis NZ3900/pNZS-SOD分別接種于5 mL GM17的液體培養基內，30 ℃過夜，次日以1%接種量接入新鮮培養基，至OD600nm在0.4～0.5之間，加入質量濃度為5 ng/mL的Nisin誘導，繼續培養5 h，4 ℃離心分別收集上清和菌體，上清于－20 ℃冷凍12 h，4 ℃解凍、離心，收集沉淀，－20 ℃備用；菌體用0.1 倍原培養體積磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）重懸，加溶菌酶37 ℃，0.5 h后用超聲波細胞破壁儀破壁，4 ℃離心收集上清液，即為菌體蛋白，－20 ℃備用。

1.3.5 表達產物的SDS-PAGE分析

分別取上清樣品（0.1 倍原上清體積的PBS溶解）和菌體樣品16 μL與4 μL蛋白上樣緩沖液（5×）混合，95 ℃變性8 min后，4 ℃離心，取16 μL上清液上樣，進行SDS-PAGE，考馬斯亮蘭染色后，觀察SOD特異條帶并掃描保存。

1.3.6 表達產物的酶活性檢測

以氯化硝基四氮唑藍（nitroblue tetrazolium，NBT）光照還原法[15]分別測定新鮮制備的上清和菌體樣品SOD活性。3 mL反應體系在光照結束后迅速以722分光光度計在560 nm波長處測定吸光度，每個樣品設5 個重復，取5 次測定的平均值，以抑制NBT光化還原反應速率的50%所需的酶量為一個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 MnSOD基因開放閱讀框序列的PCR擴增

PCR擴增MnSOD基因開放閱讀框序列，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外燈下觀察，有與目的基因大小相符的條帶，大小為726 bp左右，目的片段成功擴增。

2.2 重組質粒pMD18-T-MnSOD的構建及鑒定

PCR擴增產物經凝膠回收克隆到pMD18-T載體上。經藍白斑篩選得陽性菌株，提質粒進行PCR和雙酶切鑒定。重組質粒PCR及雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，得到與期望大小相一致的726 bp條帶（圖1），說明外源基因成功插入pMD18-T載體。將含有重組質粒pMD18-TMnSOD的菌體送至北京三博遠志生物技術有限責任公司測序。測序結果表明克隆到T載體上的MnSOD基因序列與GenBank中檢索到的大豆MnSOD序列一致，成功克隆目的基因。

圖1 T/MnSOD的鑒定Fig.1 Restriction enzyme digestion of recombinant plasmid T/MnSOD

2.3 重組質粒pNZ-SOD、pNZS-SOD的構建及鑒定

質粒pMD18-T-MnSOD經SpeⅠ、XbaⅠ雙酶切、凝膠回收后獲得線性目的基因與同樣經雙酶切、凝膠回收的線性質粒pNZ8149、pNZS以T4連接酶連接，構建了重組質粒pNZ-SOD和pNZS-SOD，重組質粒分別電轉化L. lactis NZ3900，經Elliker瓊脂板篩選，均得到多個轉化子，轉化成功。轉化子搖菌、提質粒后，PCR擴增和雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳后均得到與預期大?。?26 bp）相一致的片段，重組質粒送北京三博遠志生物技術有限責任公司測序，測序結果顯示，重組質粒所攜帶的目的基因與MnSOD基因序列一致，重組質粒構建成功，并成功導入L. lact is NZ3900（圖2～4）。

圖2 重組質粒pNZ-SOD和pNZS-SOD的構建示意圖Fig.2 Schematic representation of the organization of recombinant plasmids pNZ-SOD and pNZS-SOD

圖3 重組質粒pNZ-SOD、pNZS-SOD的PCR擴增產物Fig.3 PCR products of recombinant plasmids pNZ-SOD and pNZS-SOD

圖4 重組質粒pNZ-SOD、pNZS-SOD的限制性酶切產物Fig.4 Restriction enzyme digestion of recombinant plasmids pNZ-SOD and pNZS-SOD

2.4 重組質粒表達產物的SDS-PAGE分析

L. lactis NZ3900/pNZ8149、L. lactisNZ3900/pNZSOD和L. lactis NZ3900/pNZS-SOD經Nisin誘導表達后提取蛋白樣品進行SDS-PAGE分析，與L. lactis NZ3900/ pNZ8149和L. lactis NZ3900/pNZ-SOD相比，L. lactis NZ3900/pNZS-SOD上清樣品在約26 kD處多出一條明顯的特異性譜帶；而兩重組菌株菌體蛋白樣品比L. lactis NZ3900/pNZ8149均多出一條約26 kD大小的特異性譜帶，并且L. lactis NZ3900/pNZ-SOD株譜帶較L. lactis NZ3900/pNZS-SOD株譜帶深（圖5），這表明經改造的乳酸菌分泌表達系統能夠將外源的目的蛋白分泌到胞外，且表達量明顯高于L. lactis NZ3900/pNZ8149胞內表達系統。

圖5 重組質粒pNZ-SOD、pNZS-SOD在L. lactisNZ3900中表達產物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of pNZ-SOD, pNZS-SOD expression in L. lactisNZ3900

2.5 SOD活性檢測

經Nisin誘導培養5 h后，提取SOD粗酶液，以BeauchamP建立的NBT還原法分別測定重組質粒表達的SOD活性（表1），結果發現：L. lactis NZ3900/ pNZS-SOD表達SOD總活性和L. lactis NZ3900/pNZSOD、L. lactis NZ3900/pNZ8149菌株相比，均有極顯著（P＜0.01）提高；3 組上清樣品中，1組樣品有SOD活力，約為該組總酶活力的2/3（31.54 U/mL/47.12 U/mL），而2、3組沒有SOD活性，說明L. lactis NZ3900/pNZ8149和L. lactis NZ3900/pNZ8149菌株表達SOD在胞內，而L. lactis NZ3900/pNZS系統可將外源基因分泌到胞外，這便于目的產物的純化和利用；L. lactis NZ3900/ pNZS-SOD表達SOD總活性是L. lactis NZ3900/pNZ-SOD菌株的1.6 倍，說明經改造的分泌表達系統L. lactis NZ3900/pNZS能夠增強活性SOD表達。綜上所述，L. lactis NZ3900/pNZS系統能夠分泌表達外源的MnSOD，并增強其活性表達量，這為高效表達MnSOD的研究提供了理論依據。

表1 不同乳酸乳球菌菌株SOD酶活力測定結果Table 1 SOD activity in differentL. lactis ctis strains ains

3 討 論

MnSOD是SOD家族中的一員，其表達量與人類的衰老和多種疾病相關[16-20]。已發表的研究成果表明，MnSOD存在于真核生物的線粒體基質中[21]。以組織破碎的分離提取工藝大量獲取成本較高；傳統微生物發酵生產，菌種自身MnSOD表達量較低，且后提純工藝繁瑣，也難于大幅提高SOD產量。而應用基因工程技術將外源的MnSOD基因導入受體菌，獲得高效分泌表達MnSOD基因的菌株進行生產將解決以上難題。

應用大腸桿菌受體系統表達外源的SOD已有報道[5]，但大腸桿菌自身會產生有毒性的蛋白，所以在分離純化環節的損失和成本問題使其在生產中的應用受到限制。乳酸乳球菌表達系統L.lactis NZ3900/pNZ8149是食品級安全表達系統，可通過Nisin的誘導作用，大幅度提高外源基因的表達效率，表達產物可直接應用于食品及醫藥領域[22-23]。但其胞內表達特性使該系統的應用受到限制，而利用基因工程手段改造的食品級分泌表達系統L. lactis NZ3900/pNZS，可以分泌表達的方式表達外源基因，從而提高了外源基因的表達量。因此，應用食品級分泌表達系統表達外源基因，獲得重組微生物菌株進行發酵生產MnSOD前景廣闊。使用受體菌偏好密碼子可有效提高外源基因的表達[24]，但根據Kazusa DNA Research Institute密碼子數據庫中乳酸乳球菌基因組密碼子使用頻率數據，及GenBank已發表的大豆MnSOD基因（序列號AJ440726）密碼子使用數據，進行對比分析發現，MnSOD序列可優化密碼子低于1%，對該基因在乳酸乳球菌中的表達幾乎無影響。

本實驗分別構建了表達載體pNZ-SOD和分泌表達載體pNZS-SOD，并轉化受體菌L. lactis NZ3900，對表達產物進行SDS-PAGE和酶活性對比分析。結果表明，經改造的L. lactis NZ3900/pNZS分泌表達系統可通過SPusp45引導約2/3的外源的MnSOD基因表達產物分泌到胞外，從而增強MnSOD在乳酸菌中的表達，表達SOD總活性為出發菌株的13.5 倍，而孫強正等[25]以L. lactis MBP71為受體表達的MnSOD活性達到了出發菌株的17 倍，分析其高效表達原因可能有兩點：一是克隆的sodA基因來源于乳酸菌，與受體菌親緣關系較近，易于表達，二是克隆的sodA基因包含了同源的啟動子，增強了目的基因的表達。本實驗為SOD的高效表達研究和直接應用奠定了理論基礎，為外源基因在乳酸菌中分泌表達提供了參考。

[1] SOINI Y, VAKKALA M, KAHLOS S K, et al. MnSOD expression is less frequent in tumor cells of invasive breast carcinomas than in situ carcinomas or nonneoplastic breast epithelial cells[J]. American Journal of Pathology, 2001, 195(2): 156-162.

[2] WANG Yadi, KUMDA M, GAO Xianshu, et al. Hydrongen peroxide overload increases adriamycin-induced apopiosis of SaOS2FM, manganese superoxide dismutase-overexpressing human osteosarcoma cell line[J]. International Journal of Radiation Oncology, 2005, 26(5): 1291-1300.

[3] ZEJNILOVIC J, AKEV N, YILMAZ H, et al. Association between manganese superoxide dismutase polymorphism and risk of lung cancer[J]. Cancer Genet and Cytogenet, 2009, 189(1): 1-4.

[4] 陳堅, 林庚金, 程建, 等. 錳型超氧化物岐化酶基因轉染抑制SGC7901胃癌細胞增殖的機制[J]. 世界華人消化雜志, 2005, 13(12): 1386-1389.

[5] BREHM J K, CHAMBERS S P, BROM K J. Molecular cloning and nucleotide sequence determination of the Bacillus stearothermophilus NCA1503 superoxide dismutase and its overexpression in Escherichia coli[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 1991, 36(3): 358-363.

[6] ZHANG Yanhong, GU Jinfa, ZhAO Lili, et al. Complete elimination of colorectal tumor-xenograft by combined manganese superoxide dismutase with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand gene virotherapy[J]. Cancer Research, 2006, 66(8): 4291-4298.

[7] SONG Ningning, ZHENG Yan, LI Duochuan, et al. Cloning, expression, and characterization of thermostable manganese superoxide dismutase from Thermoascus aurantiacus var. levisporus[J]. The Journal of Microbiology, 2009, 47(1): 123-130.

[8] ZHOU Xuxia, LI Weifen, MA Guoxia. The nisin-controlled gene expression system: construction, application and improvements[J]. Biotechnology Advances, 2006, 24: 285-295.

[9] 董麗娜, 高鳳山, 許崇波, 等. 表達豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構建與鑒定[J]. 畜牧獸醫學報, 2008, 39(12): 1743-1747.

[10] 顧文亮, 夏啟玉, 姚晶, 等. 重組植物甜蛋白馬賓靈的食品級乳酸乳球菌誘導表達系統的構建[J]. 中國農學通報, 2012, 28(30): 196-200.

[11] 陳帥印, 張榮光, 范清堂, 等. 乳酸茵中幽門螺桿菌ureB基因的食品級表達與優化[J]. 鄭州大學學報: 醫學版, 2011, 46(3): 396-400.

[12] 馬超, 王丕武, 付永平, 等. 乳酸乳球菌食品級表達載體的改造[J].安徽農業科學, 2010, 38(19): 10247-10250.

[13] HOLO H, NES I F. Electroporation of Lactococcus lactis[J]. Applied and Environment Microbiology, 1989, 55: 3119-3123.

[14] MIERAU I, OLIEMAN K, MOND J, et al. Optimization of the Lactococcus lactis nisin-controlled gene expression system NICE for industrial applications[J]. Microbial Cell Factories, 2005, 4(1): 4-16.

[15] BEAUCHAMP C, FRIDOVICH I. Superoxide dismutase: Improved assay and an assay applicable to acrylamide gels[J]. Analytical Biochemistry, 1971, 44(1): 276-287.

[16] SHIMODA M S, HATTORI T, MATSUMINE H, et al. MnSOD activity and protein in a patient with chromosome 6-linked autosomal recessive parkinsonism in comparison with Parkinson disease and control[J]. Neurology, 1997, 49: 1257-1261.

[17] YEH C C, WAN X S, ST C D. Transcriptional regulation of the 5’proximal promoter of the human manganese superoxide dismutase gene[J]. DNA and Cell Biology, 1998, 17(11): 921-930.

[18] OBERLEY L W. Mechanism of the tumor suppressive effect of MnSOD overexpression[J]. Biomedicine and Pharmacotherapy, 2005, 59(4): 143-148.

[19] HITCHLER M, WIKAINAPAKU K, YU Lei, et al. Epigenetic regulation of manganese superoxide dismutase expression in human breast cancer cells[J]. Epigenetics, 2006, 1(4): 163-171.

[20] WANG Juan, LU Youyong. Mitochondrial DNA 4977 bp deletion correlated with reactive oxygen species production and manganese superoxide dismutase expression in gastric tumor cells[J]. Chinese Medical Journal, 2009, 122(4): 431-436.

[21] 王義華, 徐梅珍, 黨云琨, 等. 擬南芥MnSOD的原核表達、純化及抗體制備[J]. 生物技術通訊, 2004, 15(2): 112-114.

[22] TEUBER M, MEILE L, SCHWARZ F. Acquired antibiotic resistance in lactic acid bacteria from food[J]. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of Microbiology, 1999, 76(1): 115-137.

[23] 徐義剛, 崔麗春. 乳酸菌作為基因工程受體菌的研究展望[J]. 中國微生態學雜志, 2007, 19(1): 118-120.

[24] 賈興元, 陳星, 蘇暢, 等. 人工合成苯丙氨酸脫氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品級表達[J]. 中華微生物學和免疫學雜志, 2006, 26(1): 23-26.

[25] 孫強正, 熊衍文, 李振軍, 等. 乳酸乳球菌食品級載體的構建及Mn-SOD基因的克隆和表達[J]. 中國人獸共患病學報, 2006, 22(6): 498-501.

Cloning and Expression of Manganese Superoxide Dismutase Gene by Food-Grade Vector in Lactococcus lactis

MA Hongdan1, ZHANG Liyuan1, ZHAO Handan1, XU Dandan1, QU Jing2, GUAN Shuyan1,*, WANG Piwu2,*
(1. College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. College of Agriculture, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Open reading frame of manganese superoxide dismutase (MnSOD) from soybean was cloned into the plasmid pNZ8149 and plasmid pNZS was reformed to construct the food-grade vector. The recombinant plasmids were then separately transformed into L. lactis NZ3900 by electronic perforation, and the growth ability of the transformants was detected in Elliker medium. The recombinant plasmids named pNZ-SOD and pNZS-SOD were thus constructed successfully after PCR amplifi cation, ligation and identifi cation. The expression of L. lactis NZ3900/pNZ-SOD and L. lactis NZ3900/ pNZS-SOD was induced by nisin and their expressed products were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The SOD enzymatic activities of the transformants L. lactis NZ3900/pNZ-SOD and L. lactis NZ3900/pNZ-SOD were determined by the inhibition of nitrotetrazolium. The SOD enzymatic activity of the transformant L. lactis NZ3900/pNZS-SOD (with two thirds of extracellular SOD) was 1.6 times higher than that of the transformant L. lactis NZ3900/pNZS-SOD and 13.5 times higher than that of the parent strain. Hence, the expression of MnSOD was enhanced in L. lactis NZ3900/pNZS.

manganese superoxide dismutase (MnSOD); food-grade vector; Lactococcus lactis

Q786

A

1002-6630（2015）01-01135-05

10.7506/spkx1002-6630-201501026

2014-01-15

農業科技成果轉化資金項目（2013GB2B100125）；吉林省科技支撐計劃項目（20120215）；吉林農業大學啟動基金項目（201242）

馬紅丹（1988—），女，碩士，研究方向為植物分子生物學與基因工程。E-mail：mhd522@126.com

*通信作者：關淑艷（1971—），女，教授，博士，研究方向為分子生物學與基因工程。E-mail：458194095@qq.com王丕武（1958—），男，教授，博士，研究方向為分子生物學與基因工程。E-mail：piwuw@163.com