耐熱木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶的共表達及應用

沈藝紅，薛業敏,*，侯靜靜，許家興，李相前

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.淮陰師范學院 江蘇省生物質能與酶技術重點實驗室，江蘇 淮安 223000；3.淮陰工學院 江蘇省生物質轉化與過程集成工程實驗室，江蘇 淮安 223003）

耐熱木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶的共表達及應用

沈藝紅1，薛業敏1,*，侯靜靜1，許家興2，李相前3

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.淮陰師范學院 江蘇省生物質能與酶技術重點實驗室，江蘇 淮安 223000；3.淮陰工學院 江蘇省生物質轉化與過程集成工程實驗室，江蘇 淮安 223003）

目的：提高海棲熱袍菌（Thermotoga maritima MSB8）來源的木聚糖酶XynB和α-葡萄糖醛酸苷酶AguA生產效率并降低生產成本。方法：利用基因重組技術將海棲熱袍菌的XynB和AguA基因置于不同表達盒下構建共表達載體pET-20b-xynB-aguA和pET-28a-xynB-aguA，分別轉化大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）進行誘導表達，獲得雙酶混合物進而水解樺木木聚糖及玉米芯。結果：重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA比E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA產酶更具優勢，在LB培養基中誘導培養8 h，XynB和AguA的產量分別達到7.6 U/mL和0.5 U/mL，在TB培養基中培養，XynB可達到10.27 U/mL，AguA為1.5 U/mL。在80 ℃水解條件下，雙酶比單一木聚糖酶能夠更徹底降解樺木木聚糖，所得酶解液中木二糖的含量和純度更高；從還原糖釋放量及電子顯微鏡觀察可以看出雙酶液對農副產品玉米芯具有良好的降解作用。結論：XynB和AguA基因（T. maritima）的克隆共表達具有可行性，并且在生物轉化、食品工業和飼料生產等領域具有潛在應用前景。

木聚糖酶；葡萄糖醛酸苷酶；共表達；水解

我國是一個農業大國，每年可產各種農作物秸桿約5.7億 t，玉米芯0.4億 t[1]。這些農業廢棄物絕大部分被燃燒掉，既浪費資源又造成環境污染。若將其降解為低聚木糖，可作為功能因子，具有顯著的雙歧桿菌增殖能力、抗消化性、無齲齒性及促進人體對鈣的吸收等生理活性[2-4]。因此開發利用這一類半纖維素可再生資源，既可以相對減緩資源匱乏，又能達到清潔環境的效果，具有良好的經濟效益和社會效益。

到目前為止，已有大量微生物及其所產木聚糖酶用于制備低聚木糖[5-6]。但已有研究表明，玉米芯、甘蔗渣和秸稈等農林廢棄 物中約94%的半纖維素是阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖[12]，其結構是以β-1,4糖苷鍵連接的多聚木糖鏈[7]，在D-木糖的第二位氧上連接有D-葡萄糖醛酸并在第3位氧上連接有L-阿拉伯呋喃糖。當木聚糖酶作用木聚糖底物時，這些側鏈的存在妨礙了木聚糖 酶對木聚糖底物糖苷鍵的水解[8-9]。α-葡萄糖醛酸苷酶水解葡萄糖醛酸與木聚糖主干上木糖殘基間的α-1,2糖苷鍵，能協同木聚糖酶的水解作用，加速低聚糖的產生[10-11]。研究表明：α-葡萄糖醛酸苷酶、阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶的聯合作，不僅加速木聚糖產生木寡糖的反應速度，而且使酶解產物中帶有葡萄糖醛酸或阿拉伯糖側枝的大片段得到有效水解，從而提高低聚木糖的產量和純度[12-14]。Fan Zhanmin等[15]通過連接肽將木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶以及木糖苷酶3 種基因進行共表達，結果表明該融合蛋白仍保留有原先各自酶的特性，且對于木聚糖的水解具有協同作用。因此，構建既產α-葡萄糖醛酸苷酶又產木聚糖酶活性的基因工程菌成為獲得更高效降解秸稈木聚糖和價格低廉的生物催化劑的途徑。

海棲熱袍菌（Thermotoga maritima MSB8）生長在55～90 ℃的海底火山口附近[16-17]，是一種嚴格厭氧，桿狀、無孢子的發酵型真細菌，該菌所產木聚糖酶B（XynB）和α-葡萄糖醛酸苷酶（AguA）的熱穩定性好，在生物處理過程中具有減少污染危險、加快反應速度、提高酶作用底物溶解度和較高的抗化學變性等優點，可以彌補現有酶法水解木聚糖存在的底物作用濃度低、易污染帶來的效率低和成本高的不足。利用基因重組技術將T. maritima的XynB和AguA基因置于不同表達盒下，構建雙啟動子共表達載體pET-20b-xynB-aguA和pET-28axynB-aguA，分別轉化大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）構建出既產α-葡萄糖醛酸苷酶又產木聚糖酶的基因工程菌E.coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA和E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA，并用誘導表達所獲得木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶的雙酶混合物來水解樺木木聚糖及玉米芯，進一步檢測還原糖釋放量并通過TLC分析酶解產物中各組分的變化，比較分析單一木聚糖酶和雙酶的水解效率，并對水解前后玉米芯進行掃描電鏡分析。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

質粒pET-28a購自美國Novagen公司，含有海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）木聚糖酶B（XynB）或葡萄糖醛酸苷酶（AguA）的質粒pHsh-aguA（構建方法見文獻[13]）、pET-20b-xynB （構建方法見文獻[18]）。大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）與Escherichia coli TOP10（Promega）分別作為目的基因的表達宿主和克隆宿主。

1.2 試劑與儀器

限制性內切酶XhoⅠ、XbaⅠ、T4 DNA連接酶和Pyrobest DNA聚合酶 華美生物工程公司和寶生物工程公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 美國Promega公司；QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit、QIAquick Gel Extraction Kit 美國Qiagen公司；低聚木糖標樣95%純度（木二糖） 山東龍力生物科技股份有限公司。

GF254硅膠板 山東江友硅膠開發有限公司；PCRMastercycler Personal PCR儀 德國Eppendorf公司；核酸凝膠電泳儀、蛋白電泳儀和凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；JY92-II超聲波細胞破碎儀 上海新芝生物技術研究所。

1.3 培養基和培養條件

大腸桿菌培養在LB或TB培養基，轉化用SOC培養基，轉化子的選擇用含有氨芐青霉素（100 μg/mL）或卡那霉素（30 μg/mL）的培養基。

1.4 方法

1.4.1 共表達質粒的構建

以質粒pHsh-aguA為模板，利用相應的上下游引物1和2（引物1：5′-AAAAGGCCTTGACCCCCTTG AATGTGGGGGGAAACA-3′內有StuⅠ酶切位點；引物2：5′-CGGCTCGAGCGGATATATATATCTTT CTTCCC-3′內有XhoⅠ酶切位點）聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增基因片段-Hshrbs-aguA-（Hsh啟動子調控的AguA基因）。擴增條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 40 s、53 ℃ 40 s、72 ℃ 3 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩下產物割膠回收純化。用限制性內切酶StuⅠ和XhoⅠ分別對純化后PCR產物和pET-20b-xynB載體進行雙酶切，膠回收pET-20b-xynB線性載體和目標基因，用T4 DNA 連接酶在16 ℃條件下連接載體和目標基因過夜。連接產物轉化E. coli TOP10感受態細胞，涂布Amp抗性平板，通過對轉化子酶切驗證和測序，確認獲得陽性質粒pET-20b-xynB-aguA。基因測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，共表達質粒pET-20b-xynB-aguA構建方案見圖1。

圖1 共表達載體pET-20b-xynB aguA的構建Fig.1 Construction of coexpression vector pET-20b-xynB-aguA

以質粒pET-20b-xynB-aguA為模板，利用上下游引物3、4（引物3：5′- TGCTCTAGAAATAATTTTGTTTAAC TTTAAGA-3′內有XbaⅠ酶切位點；引物4：5′-CGGCTC GAGCGGATATATATATCTTTCTTCCC-3′內有XhoⅠ酶切位點）PCR擴增片段-xynB-aguA-（分別由T7和Hsh啟動子調控的共表達基因XynB-AguA）。擴增條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 40 s、56℃ 40 s、72 ℃ 3 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物驗證正確后過柱純化，限制性內切酶XbaⅠ和XhoⅠ分別對PCR產物和pET-28a載體雙酶切。割膠回收、連接、轉化及驗證步驟同上，陽性質粒命名為pET-28a-xynB-aguA，重組質粒構建方案見圖2。

圖2 共表達載體pET-28a-xynB aguA的構建Fig.2 Construction of coexpression vector pET-28a-xynB-aguA

1.4.2 目的基因的誘導表達

將質粒pET-28a-xynB-aguA和pET-20b-xynB-aguA分別轉入E. coli JM109（DE3），分別挑取單菌落接入含有卡那霉素（kana 30 μg/mL）和氨芐青霉素鈉（Amp 100 μg/mL）的4 mL LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養過夜；種子液轉接至100 mL LB液體培養基（相應抗性）中，30 ℃、220 r/min振蕩培養至OD600nm達0.6～0.8后加入IPTG至終濃度0.8 mmol/L，于42 ℃誘導8 h。取菌液1 mL 以5 000×g離心10 min離心收集菌體，400 μL 50 mmol/L 鄰苯咪唑緩沖液 （pH 6.2）重懸，超聲破碎，離心取上清（ 即粗酶液）檢測胞內木聚糖酶活性性和葡萄糖醛酸苷酶活性性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（濃縮膠5%，分離膠10%）檢測XynB和AguA基因在原核表達載體中的表達情況。

1.4.3 重組菌E.coli JM109（DE3）/ pET-28a-xynB-aguA產酶

以誘導溫度42 ℃、IPTG 終濃度0.8 mmol/L為初始誘導條件，根據重組菌在TB培養基中的生長曲線變化誘導時機，誘導8 h，檢測胞內酶活性，SDS-PAGE驗證。

1.4.4 酶活性測定

XynB和AguA酶活性檢測方法分別參考文獻[19-20]。1.4.5 酶解應用

1.4.5.1 樺木木聚糖的酶解

稱取樺木木聚糖80 mg溶于pH 6.6 100 mmol/L的鄰苯咪唑緩沖液中，總體系為2 mL。以單一XynB酶解體系為對照組，實驗組加入誘導8 h的雙酶液，然后在80 ℃條件下反應1、2、4、6、8 h后，5 000×g離心10 min得上清，用DNS法測還原糖，酶添加量則以等木聚糖酶活力單位（10 U/g底物）為標準計算得到，實驗重復3 次。同時取4 μL上清用于薄層層析技術（thin-layer chromatography，TLC）分析，具體方法參考文獻[12]。

1.4.5.2 玉米芯的降解

稱取粉碎后過40 目篩的玉米芯粉末0.1 g溶于pH 6.6 100 mmol/L的鄰苯咪唑緩沖液中，反應總體系為2 mL。加入誘導8 h條件下的雙酶液，然后在80 ℃條件下反應12 h后取樣用DNS法測還原糖，并將反應后玉米芯殘渣過濾，烘干備用，實驗重復3 次。將酶解反應前后的玉米芯進行電子掃描顯微鏡觀察其微觀結構變化，水解率按下式計算。

2 結果與分析

2.1 共表達質粒的構建

將T. maritima的XynB和AguA基因置于不同表達盒下共表達，使XynB和AguA基因分別帶有獨立的啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止子，其中XynB基因置于T7啟動子下，AguA基因則置于熱啟動子Hsh[21]下（圖3），兩個基因表達相對獨立，避免多順反子表達系統存在的多基因表達不平衡性[22]，以達到調控XynB和AguA的表達比例。

圖3 共表達質粒的構建Fig.3 Construction of coexpression plasmids

以質粒pHsh-aguA為模板，利用PCR擴增獲得基因片段Hsh-aguA，大小約為2 000 bp（圖4a泳道2），純化后的PCR產物與pET-20b-xynB連接，經StuⅠ和XhoⅠ雙酶切得到大小近2 000 bp和4 700 bp的片段（圖4b泳道2），分別為PCR片段和載體片段。測序結果證實質粒pET-20b-xynB-aguA構建成功。

圖4 重組質粒pET-20b-xynB-aguA的構建Fig.4 Construction of expression vector pET-20b-xynB-aguA

以pET-20b-xynB-aguA的DNA為模板，利用PCR擴增獲得基因片段-xynB-aguA，大小約為3 000 bp（圖5泳道2），純化后的PCR產物與載體pET-28a連接，經XbaⅠ單酶切后得到約8 000 bp大小的片段（圖5泳道4），比XbaⅠ單酶切后的pET-28a載體片段（圖5泳道3）大3 000 bp左右，即目的基因片段大小。測序結果證實質粒pET-28a-xynB-aguA構建成功。

圖5 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of DNA

2.2 XynB和AguA的共表達

為了評估XynB和AguA基因在兩個不同載體pET-28a和pET-20b中的共表達效果，將構建成功的共表達質粒pET-28a-xynB-aguA和pET-20b-xynB-aguA轉化大腸桿菌E. coli JM109（DE3）進行誘導表達，分析檢測重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA和E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA在不同培養時間的生長和雙酶產量（圖6）。結果正如圖6A所示，E.coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA和E. coli JM109（DE3）/ pET-20b-xynB-aguA生長趨勢一致，3 h之前菌體處于生長延滯期，3～4 h處于對數生長期，此時加入IPTG進行誘導，當誘導至6～12 h時菌體生長處于平緩期，且由圖可見E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA的菌體生長和最高OD600nm值（3.6），明顯高于E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA最高OD600nm值（2.5）；進一步檢測XynB和AguA的產量發現，重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA更具優勢，其結果見圖6B，重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA和E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA中XynB和AguA隨著誘導時間的增加而增加，誘導培養8 h后雙酶產量達到最高，分別為7.6 U/mL（XynB）、0.5 U/mL（AguA）以及1.7 U/mL（XynB）、0.06 U/mL（AguA），XynB和AguA基因在載體pET-28a比在pET-20b中表達的產酶水平分別提高3.5 倍和7.3 倍；這可能與pET-28載體存在一個額外表達阻遏蛋白lacI基因有關，相反，pET-20b載體不含有阻遏蛋白lacI基因，這樣當外源基因高效表達時宿主本身表達的阻遏蛋白量遠遠不足于控制啟動子的轉錄翻譯而同時又無額外阻遏蛋白的補充，繼而產生外源蛋白的滲漏表達造成對菌體生長的抑制而影響重組菌的產酶水平，這也被圖6A重組菌的生長曲線結果所印證。取等體積粗酶液進行SDS-PAGE（12%分離膠），并以空載pET-20b為對照，考馬斯亮藍染色的結果見圖6C，XynB（43 kD）和AguA（72 kD）基因在載體pET-28a中的表達量（圖6C：泳道6、7、8）明顯高于其在pET-20b中的表達量（圖6C：泳道3、4、5），與圖6B的產酶水平結果一致。

圖6 兩種重組菌中XynB和AguA的表達Fig.6 Expression levels of XynB and AguA in two recombinant E. coli strains

有研究表明TB培養基更有利于重組菌目的蛋白的表達[23]，本實驗將重組菌E. coli JM109（DE3）/ pET-28a-xynB-aguA置于TB培養基中培養，觀察其生長狀況，結果見圖7。可以看出，OD600nm在0.5～2.0、2.0～3.5和3.5～5.0時分別為菌體生長的延滯期、對數期和中后期，菌體生長至6 h時OD600nm可達4.5。

圖7 重組菌在TB培養基中生長曲線Fig.7 Growth curves of recombinant E. coli in TB medium

重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA在不同時機即OD600nm為分別1.0、2.0和3.5時加入IPTG誘導8 h后，測得在對數期誘導產酶量最高，其中XynB為10.27 U/mL，AguA為1.5 U/mL（表1），表明誘導時機對基因表達效果影響很大[24]，加入過早或過遲，雙酶的表達水平都不夠理想。延滯期菌體生長密度低，因IPTG有一定毒性，過早加入誘導劑會抑制菌體生長，而菌體生長中后期時，大多菌體已趨于成熟，生長活力較低，且培養過程中積累了一定的代謝副產物不利于外源蛋白的合成。收集菌體并破細胞，離心得上清取等體積進行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色表明，在菌體生長的對數期時添加誘導劑所產生的XynB和AguA條帶最粗（圖8，泳道3），這與其產酶水平的分析結果（表1）一致。

表1 重組菌E. coli JM109（DE3）/ pET-28a-xynB-aguA不同誘導時機產酶量（酶活性）Table 1 Expression levels of recombinantE. coli JM109 (DE3)/ pET-28a-xynB-aguA with different induction time points

圖8 不同誘導時機XynB和AguA的表達Fig.8 Expression levels of XynB and AguA with different induction time points

后續研究將進一步提高重組菌E. coli JM109（DE3）/ pET-28a-xynB-aguA的產酶水平，優化XynB和AguA活力比例使其達到最佳酶解效率。

2.3 樺木木聚糖的酶解

樺木木聚糖是典型的4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖，為了評估木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶共同降解純化木聚糖的效果，本實驗選擇樺木木聚糖為底物，以4 g/100 mL的底物，加入重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-28axynB-aguA所產的雙酶液（其中XynB為10 U/g和AguA為1 U/g），在80 ℃條件下水解不同時間，以單一木聚糖酶（重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB所產的XynB，10 U/g）水解為對照，通過DNS測定還原糖釋放量以及TLC分析酶解產物組分（圖9），比較雙酶與單酶水解木聚糖底物的效率。

圖9 單一木聚糖酶和雙酶對樺木木聚糖水解的還原糖釋放量（A）和TLC圖譜（BB）Fig.9 Sugar release (A) and TLC spectrum(B) on single and dual enzymatic hydrolysis of birch xylan

由圖9A可知，雙酶與單一木聚糖酶水解釋放還原糖量均隨著酶解時間的延長而增加，且雙酶水解時，還原糖釋放變化率較單酶快，隨著時間的延長，還原糖釋放質量濃度持續增加，水解8 h后還原糖釋放質量濃度達到20 mg/mL，高于單酶水解還原糖釋放質量濃度的14 mg/mL，表明雙酶具有更高的水解效率。由圖9B可知，當水解1 h時，雙酶水解產物中木二糖及以上聚合度寡糖完全降解（圖9B中泳道7），而單酶水解產物中直至8 h仍有更高聚合度木寡糖殘留（圖9B中泳道6），這表明雙酶具有更高的催化效率，其含有的葡萄糖醛酸苷酶比例足以保證樺木木聚糖的徹底降解；同時，與單酶水解產物相比，雙酶水解液中木二糖含量和和純度更高（圖9B中泳道7～10，產物主要為木二糖），這些結果表明，木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶間存在著協同水解作用，當葡萄糖醛酸苷酶水解去除掉葡萄糖醛酸側枝后減少了木聚糖酶作用底物的空間位阻，而提高水解木聚糖底物的效率。與Sunna等[10]的研究結果一致。且已有研究表明，低聚木糖，尤其是木二糖對于雙歧桿菌增殖具有促進作用[25-26]，被稱為“超強雙歧因子”，它可以抑制腸道內腐敗菌的生長，改善腸道微生態環境，有調節機體生理功能，增強人體免疫力，預防疾病發生的效果[27]。本實驗雙酶制得的低聚木糖不僅木二糖含量更高且純度更好，具有潛在的應用前景。

2.4 玉米芯的降解

玉米芯是重要的農業廢棄物，廣泛用于飼料加工業[28-29]，為提高其可消化率，本實驗選擇玉米芯為底物，嘗試木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶共同降解玉米芯的效果，并用DNS法測定還原糖釋放率，結果顯示玉米芯經雙酶液水解后水解率可達到24%。用掃描電鏡觀察玉米芯酶處理前后表面形態的變化的結果見圖10。從300 倍電鏡掃描（圖10A、10C）可以看出，未處理玉米芯表面結構致密，呈現有序、有規律的排列，纖維表面比較完整，無損傷，存在著細小的褶皺硅質；酶處理后的玉米芯表面出現許多致密的孔洞，且表面“溝壑狀”結構清晰可見。從1 000 倍電鏡掃描（圖10B、10D）可以看出，未處理玉米芯表面被許多被突起、硅細胞、栓細胞所覆蓋，整體排列緊密；而酶處理后玉米芯表面明顯有破洞，表明其半纖維結構被酶水解破壞，且酶法處理比Kahar等[30]報道的硫酸處理法更溫和且環保，因此表明該雙酶液降解效果顯著。玉米芯含粗蛋白、粗脂肪、粗纖維，還含有豐富的礦物質、維生素和微量元素[31]，不僅可作為制取益生因子低聚木糖的理想來源，還可以將玉米芯粉經過酶預處理后促進有效物質的釋放，以及降低飼料用糧中的非淀粉多糖，促進營養物質的吸收利用，增強牲畜適口性，因此具有一定的工業應用價值。

圖10 玉米芯酶解前后電子顯微鏡圖Fig.10 Electron microscope pictures of corncob before and after enzymatic hydrolysis

3 結 論

海棲熱袍菌是極耐熱性酶的重要來源，但該菌生長條件要求苛刻，細胞密度較低，不適合工業化生產。因此，構建合適的極端菌的外源基因表達系統來高效表達耐熱耐堿酶蛋白，一直是人們研究的熱點，且分別生產多個木聚糖降解酶既耗費時間又浪費資金。本研究選用大腸桿菌Escherichia coli JM109（DE3）為表達宿主，采用基因工程技術構建共表達載體pET-20b-xynB-aguA和pET-28a-xynB-aguA在大腸桿菌中同時生產XynB和AguA從而獲得雙酶混合物，結果表明重組菌E.coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA在LB培養基中誘導培養8 h，XynB和AguA的產量分別達到7.6 U/mL和0.5 U/mL，比重組菌E. coli JM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA產酶提高近一倍，進一步在TB培養基中培養，XynB可達到10.27 U/mL，AguA為1.5 U/mL；在低聚木糖的制備中，雙酶在相同的條件下相比單酶能夠徹底快速地水解樺木木聚糖產生木寡糖，酶解產物中木二糖含量及純度更高，且對農副產品玉米芯具有良好的降解效果。有報道[32]表明，動物食用含低聚木糖的飼料后，能提高動物對營養物質的吸收，增強免疫力。為能夠將該嗜熱木聚糖酶系應用于食品釀造或其他加工行業，還需進行進一步的探索，如選擇食品安全級的表達宿主：枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等。

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Coexpression and Application of Thermostable Xylanase and Glucuronidase

SHEN Yihong1, XUE Yemin1,*, HOU Jingjing1, XU Jiaxing2, LI Xiangqian3
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. Jiangsu Key Laboratory for Biomass-based Energy and Enzyme Technology, Huaiyin Normal University, Huaian 223000, China; 3. Jiangsu Provincial Engineering Laboratory for Biomass Conversion and Process Integration, Huaiyin Institute of Technology, Huaian 223003, China)

Objective: To improve the productivity and reduce production costs of xylanase (XynB) and α-glucuronidase (AguA) from Thermotoga maritima MSB8. Methods: Gene recombination technology was used to clone the XynB and AguA genes into different BioBrick base vectors, thus constructing pET-20b-xynB-aguA and pET-28a-xynB-aguA. These plasmids were then transformed into Escherichia coli JM109 (DE3), respectively, to induce the coexpression of the two enzymes for hydrolysis of birch xylan and corncob. Results: After 8 hours of induction, the recombinant E. coli JM109 (DE3)/pET-28a-xynB-aguA produced XynB and AguA with the yields reaching 7.6 and 0.5 U/mL in LB medium, respectively, which were higher than those of E. coli JM109 (DE3)/pET-20b-xynB-aguA. In TB medium, XynB activity reached 10.27 U/mL and AguA activity reached 1.5 U/mL. At 80 ℃, combination of both enzymes degraded birch xylan more thoroughly than single xylanase, resulting in a higher content and purity of xylobiose in hydrolyzate. The amount of reducing sugar released and electron microscopy observation revealed good degradation of corncob. Conclusions: Cloning and co-expression of XynB and AguA from T. maritima are practicable and the recombinmant XynB and AguA have potential applications in biotransformation, food industry, feed production and other areas.

xylanase; glucuronidase; coexpression; hydrolysis

Q814.9

A

1002-6630（2015）01-0146-07

10.7506/spkx1002-6630-201501028

2014-01-14

江蘇省生物質能與酶技術重點實驗室開放課題（JSBEET1301）；

江蘇省生物質轉化與過程集成工程實驗室開放課題（JPELBCPL2012002）

沈藝紅（1989—），女，碩士，研究方向為營養與食品功能因子。E-mail：shenyihong1989@foxmail.com

*通信作者：薛業敏（1963—），女，教授，博士，研究方向為分子生物學與可再生資源。E-mail：xueyemin@njnu.edu.cn