矢車菊素-3-葡萄糖苷對人巨核細胞株Dami增殖分化的影響

任 婧，鄧秀娟，王燕燕，張莉珂，牙甫禮，盧敏琪，張 擎，楊 燕,*

（1.中山大學公共衛生學院，廣東 廣州 510080；2.廣東省營養膳食與健康重點實驗室，廣東 廣州 510080；3.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275）

矢車菊素-3-葡萄糖苷對人巨核細胞株Dami增殖分化的影響

任 婧1,2，鄧秀娟1,2，王燕燕1,2，張莉珂1,2，牙甫禮1,2，盧敏琪1，張 擎3，楊 燕1,2,*

（1.中山大學公共衛生學院，廣東 廣州 510080；2.廣東省營養膳食與健康重點實驗室，廣東 廣州 510080；3.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275）

目的：研究植物花色苷單體矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-β-glucoside，Cy-3-g）對人巨核細胞株Dami的增殖、分化作用。方法：不同濃度的花色苷Cy-3-g（0.05、0.50、5.00、50.00、100.00 μmol/L）與人巨核細胞株Dami細胞共同培養，并將用完全培養基培養的細胞設為對照組。培養結束后，用臺盼藍染色法檢測巨核細胞活性、噻唑藍（methyl thiazo lyl tetrazolium，MTT）染色法檢測細胞增殖能力，軟瓊脂細胞集落培養法觀察巨核細胞集落生成情況。采用Giemsa染色法觀察細胞形態、流式細胞術檢測巨核細胞DNA多倍體的生成及細胞表面CD41陽性表達率。結果：與對照組相比，50.00、100.00 μmol/L的Cy-3-g可增強Dami細胞活性，差異具有統計學意義（P＜0.05）；各Cy-3-g劑量組與對照組相比，均可明顯增強Dami細胞增殖能力（P＜0.01）；Dami細胞集落數目、DNA多倍體數目以及CD41的陽性表達率在50.00、100.00 μmol/L Cy-3-g作用下明顯升高，且與對照組相比均具有統計學差異（P＜0.01）。結論：Cy-3-g能夠明顯促進人巨核細胞株Dami的增殖、分化，這可以為花色苷促進血小板生成提供可能的理論依據。

矢車菊素-3-葡萄糖苷；巨核細胞；增殖；分化

心血管疾病（cardiovascular diseases，CVDs）嚴重威脅著人類健康與生命，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為心血管疾病中一種常見的血管病變已成為CVD疾病死亡的主要原因。有研究發現，血小板參與AS的發生、發展和斑塊形成等過程，尤其在動脈粥樣硬化灶破損后，會引發大量的血小板黏附與聚集，進而導致血管閉塞和血栓性疾病，如心肌梗塞和腦梗塞，已經成為人類健康的第一殺手[1]。因此，對血小板黏附與聚集的深入研究不僅有利于出血性疾病的診斷治療，對血栓性疾病的診治也起著重要的促進作用。大量研究表明，植物性食物具有廣泛的促進健康和預防心血管疾病的作用[2]。花色苷是植物化學物中一類重要的黃酮類化合物，常以糖苷的形式存在，是自然界中廣泛存在于植物中的水溶性天然色素。花色苷不同程度地存在于大部分植物花瓣和果實種皮中，其中以深色漿果如葡萄、越橘、藍莓、桑葚，有色薯類如紫番薯，谷物如高梁、紫玉米和黑米中含量尤為豐富[3]。

近年來大量的研究以及本課題組的研究結果均發現膳食花色苷的攝入可以抑制AS發展以及抑制血小板的激活和血栓形成[4-6]。近期本課題組的研究結果還發現，花色苷單體可以促進活化血小板凋亡，且其能夠通過調控Bcl-2家族中凋亡/抗凋亡蛋白水平來促進活化血小板凋亡[7-8]。血小板凋亡后必然會引起血小板數目的減少，繼而延長機體凝血時間。但是前期的研究結果顯示，花色苷并未引起小鼠出血時間的延長[6]。而血小板主要來源于巨核細胞，那么花色苷是否可以通過促進機體巨核細胞增殖分化而增加血小板生成來維持血小板數目穩定呢？因此，本實驗擬通過體外研究花色苷單體矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-β-glucoside，Cy-3-g）對人巨核細胞株Dami的增殖分化作用，從而為花色苷調控巨核細胞的功能以及血小板的生成提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Dami細胞由中山大學生命科學學院張擎教授實驗室惠贈。

Cy-3-g（純度為99.9%） 挪威Polyphenol AS公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Gibco公司；雙抗（青霉素、鏈霉素）美國Thermo公司；臺盼藍 加拿大BioBasic有限責任公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 廣州艾斯金生物科技有限公司；β-巰基乙醇 美國Amresco公司；姬姆薩（Giemsa）色素 國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉 日本廣野公司；人血小板生成素（human thrombopoietin，TPO） 美國PeproTech公司；CD41-FITC 美國BioLegend公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料、RNA酶 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀 瑞士Tecan公司；倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司；FACS Calibar流式細胞儀（配有Cell Quest軟件） 美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及分組

RPMI-1640培養基中添加體積分數10%胎牛血清和1%雙抗配成完全培養基，于37 ℃、5% CO2、95%相對濕度條件下培養人巨核細胞株Dami，取對數生長期的細胞用于實驗。Cy-3-g粉末溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，使儲備液濃度為100 mmol/L，取100 μL分裝后存放于－80 ℃冰箱中，使用時用完全培養基稀釋至所需濃度。細胞分組：按Cy-3-g濃度分為0.05、0.50、5.00、50.00、100.00 μmol/L 5 組與Dami細胞共同培養，將完全培養基培養的細胞設為對照組。

1.3.2 臺盼藍染色實驗檢測細胞活性

將按照1.3.1節方法常規培養2 d的各組細胞懸液與質量分數0.4%的臺盼藍染液按體積比9∶1混合后，滴入計數板。靜置 1 min，使懸浮細胞下沉，在顯微鏡下計數。未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞。按照下式計算活細胞比例。

1.3.3 MTT細胞增殖實驗

細胞達到對數生長期后按5×104個/mL的密度接種于96 孔板中，每孔體積200 μL，每組設6個復孔。放入培養箱中常規培養48 h后離心，棄去上清液，每孔加入20 μL質量分數0.5% MTT溶液，繼續培養4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，在微量振蕩儀上振蕩5 min，于酶標儀上570 nm波長處測定吸光度。

1.3.4 細胞集落培養實驗

取無菌離心管5 支，按體積分數依次加入60% RPMI-1640培養基、10% β-巰基乙醇（10 mmol/L）、10% FBS、10%各組細胞懸液（調整細胞密度為104個/mL）、50 ng/mL TPO，混勻后在37 ℃條件下預熱。取預熱的瓊脂迅速按10%體積分數加入到各組細胞懸液中，混勻后接種于3.5 cm培養皿上。數十分鐘后待其凝固，放入培養箱中常規培養[9]。5 d后取出，在顯微鏡下觀察細胞集落生長情況（細胞集落生成越多、越大，表明細胞增殖能力越強），每個培養皿底以“米”字等分為8 份，每份中選取兩個視野，記錄每組集落數目之和，大于或等于10 個細胞記為一個集落。

1.3.5 細胞Giemsa染色實驗

細胞常規培養2 d后取各組細胞涂于載玻片上。待自然晾干后，于甲醇中固定5 min，然后在Giemsa染色液中浸染20 min，流水沖洗后晾干，中性樹膠封固并在顯微鏡下觀察，選取每張載玻片的4 個頂角及載玻片中間共5 個視野拍照。

1.3.6 流式細胞儀定量檢測細胞DNA多倍體

收集常規培養2 d的各組細胞于潔凈的EP管中，調整細胞密度為1×106個/mL。細胞固定15 min后用體積分數70%乙醇通透細胞1 h，洗滌細胞兩次，取100 μL細胞懸液于流式細胞上樣管中，加入RNA酶，37 ℃條件下孵育20 min，再加入PI染料（對照組不加），避光作用20 min后每管加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）至500 μL，用流式細胞儀檢測細胞DNA濃度分析其多倍體生成情況[10]。

1.3.7 流式細胞術測定細胞表面CD41含量

流式細胞術細胞樣本收集同1.3.6節，細胞洗滌兩次后取100 μL細胞懸液于流式細胞上樣管中，分別加入流式抗體CD41-FITC，每組設兩個平行樣并設IgG同型對照組。細胞與抗體避光孵育15 min后，每管加入400 μL PBS，在流式細胞儀上檢測其表達情況。

1.4 數據分析

每項實驗至少重復3 次，數值采用SPSS 16.0軟件包進行統計分析，結果以表示。多組均數的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間的比較采用t檢驗分析。采用Graphpad Prism 5軟件制作統計圖。

2 結果與分析

2.1 Cy-3-g對人巨核細胞株Dami活性的影響

圖1 Cy-3-g對人巨核細胞株Dami細胞活性的影響Fig. 1 Effect of Cy-3-g on viability of megakaryocytic cells

各組細胞在培養箱中培養2 d后，計算其活細胞比例。由圖1可知，50.00、100.00 μmol/L花色苷Cy-3-g與細胞共同培養后，活細胞比例達到98.07%和99.25%，與對照組（88.10%）相比，細胞活性明顯升高（P＜0.05），但0.05、0.50、5.00 μmol/L花色苷Cy-3-g對細胞活性的影響與對照組相比沒有統計學差異。

2.2 Cy-3-g對人巨核細胞株增殖能力的影響

MTT法檢測Cy-3-g對Dami細胞增殖能力的影響，如圖2所示，各濃度Cy-3-g均可明顯增強Dami細胞的增殖能力，且與對照組相比，具有統計學差異（P＜0.01）。

圖2 MTT法檢測Cy-3-g對Dami細胞的增殖作用Fig.2 Proliferation effect of Cy-3-g on Dami cells tested by MTT

2.3 Cy-3-g對Dami巨核細胞集落生成的影響

圖3 Cy-3-g對Dami巨核細胞集落生成的影響Fig.3 Effect of Cy-3-g on colony formation of Dami cells

Dami巨核細胞集落培養結果如圖3所示，與對照組相比，50.00、100.00 μmol/L Cy-3-g共同培養的細胞集落生成數目≥30 個（圖3B），明顯高于對照組≤10 個（圖3A）（其他劑量組圖片未列出），且差異具有統計學意義（P＜0.01），但0.05、0.50、5.00 μmol/L Cy-3-g劑量組的細胞集落生成數目與對照組相比沒有統計學差異（圖3C）。

2.4 Cy-3-g對Dami細胞DNA多倍體生成的影響

圖4 Cy-3-g對Dami巨核細胞多倍體的影響Fig.4 Effect of Cy-3-g on cell polyploidy of Dami cells

如圖4所示，對照組與0.05、0.50、5.00 μmol/L劑量花色苷共同孵育的細胞倍體多為2N，僅有少量呈多倍性（圖4A，0.05、0.50、5.00 μmol/L劑量組圖片未列出），計數后發現≥4N的細胞占細胞總數的8.38%，而50.00、100.00 μmol/L Cy-3-g與細胞共同培養后與對照相比，多核細胞明顯增多（圖4B）（P＜0.01），分別約占細胞總數的33.88%和26.44%（圖4C）。流式細胞儀檢測細胞DNA多倍體數目結果顯示，與對照組（8.90%）（圖4D）相比，50.00 μmol/L Cy-3-g與細胞共同培養后＞8N細胞比例（32.30%）（圖4E）明顯增加（P＜0.01）。但0.05、 0.50、5.00 μmol/L劑量的花色苷對巨核細胞多倍體的影響與對照組相比沒有統計學差異（圖4F）。

2.5 Cy-3-g對Dami巨核細胞表面CD41表達量的影響

圖5 Cy-3-g對Dami巨核細胞表面CD41表達率的影響Fig.5 Effect of Cy-3-g on CD41 expression rate on the surface of Dami cells

流式細胞術檢測細胞表面CD41陽性表達率。如圖5所示，與對照組相比，高劑量花色苷（50.00、100.00 μmol/L）與細胞共同孵育后表面CD41表達率明顯增加（P＜0.01）。高劑量Cy-3-g可增加細胞成熟度，但0.05～5.00 μmol/L低劑量組與對照組相比沒有統計學差異（圖5B）。

3 討 論

巨核細胞增殖分化是血小板產生的前提，巨核細胞經過成熟、前血小板的產生、細胞內外環境作用等一系列過程后最終將血小板釋放到血液中[11]。促進巨核細胞增殖分化可以維持體內血小板活化凋亡后數目的穩定[12]。巨核細胞大小不一，直徑為12～120 μm，是體內唯一可以進行核內有絲分裂的細胞，其細胞核的數目可以從2N、4N、8N、16N到32N，最多可達到128N甚至更多，隨著多倍體數目的增多，細胞的分化能力逐漸增強[13]。伴隨著細胞核的成熟，巨核細胞表面特異性的蛋白表達量可以反映巨核細胞的細胞質成熟度。

Dami細胞是人源巨核系細胞株，它具有巨核細胞的基本特性，其表面含有大量與血小板相同的糖蛋白如CD41、CD61、CD42b等，其中CD41表達量最多，是研究人巨核細胞生理生化、分化成熟機理及其與血小板關系的理想模型[12,14]。本研究首次發現高濃度花色苷單體Cy-3-g（50.00、100.00 μmol/L）能明顯增強Dami細胞活性（圖1）；MTT法與細胞集落培養法的結果均表明細胞增殖能力在Cy-3-g作用下也明顯增強（圖2、3）；細胞Giemsa染色實驗與細胞DNA多倍體檢測結果分別定性、定量地說明了細胞在Cy-3-g作用下分化能力顯著增強（圖4），與此同時細胞的成熟度也相應增加（圖5）。因此，花色苷單體Cy-3-g能夠在體外有效促進人巨核細胞的增殖分化。

目前關于植物性食物對于巨核細胞增殖分化的研究主要集中在中草藥中某些成分的作用方面，如地榆提取物總皂苷、腫節風總黃酮等分別對巨核祖細胞和小鼠巨核細胞有明顯的增殖分化作用[15-16]。莫姝等[17]發現當歸多糖能夠有效刺激巨核細胞的增殖，可為血小板減少癥的輔助治療提供一定的理論依據。目前臨床上對于血小板減少癥主要采用促血小板生成素（TPO）進行治療，雖然TPO能夠有效刺激巨核細胞的增殖分化并產生具有生理功能的血小板[18]，但是在臨床實驗中也會對病人產生一定的不良反應，如誘發血栓以及不可逆骨髓網狀纖維增生等多種并發癥或后遺癥[19-20]。因而，探索并發現更多具有促血小板生成作用的功能性食物成分，如花色苷等植物化合物對疾病的預防與治療具有重要意義。

[1] RUGGERI Z M. Platelets in atherothrombosis[J]. Nature Medicine, 2002, 8(11): 1227-1234.

[2] DALEN J E, DEVRIES S. Diets to prevent coronary heart disease 1957-2013: what have we learned?[J]. The American Journal of Medicine, 2014, 127(5): 364-369.

[3] LI Xinying, MA Hongyan, HUANG Huilian, et al. Natural anthocyanins from phytoresources and their chemical researches[J]. Natural Product Research, 2013, 27(4/5): 456-469.

[4] RECHNER A R, KRONER C. Anthocyanins and colonic metabolites of dietary polyphenols inhibit platelet function[J]. Thrombosis Research, 2005, 116(4): 327-334.

[5] ZHU Yanna, XIA Min, YANG Yan, et al. Purified anthocyanin supplementation improves endothelial function via NO-cGMP activation in hypercholesterolemic individuals[J]. Clinical Chemistry, 2011, 57(11): 1524-1533.

[6] YANG Yan, SHI Zhenyin, REHEMAN A, et al. Plant food delphinidin-3-glucoside significantly inhibits platelet activation and thrombosis: novel protective roles against cardiovascular diseases[J]. PLoS One, 2012, 7(5): e37323. doi: 10.1371/journal.pone.0037323.

[7] 田金舉, 陳禮儀, 宋豐林, 等. 花色苷誘導健康人血小板線粒體凋亡通路的體外研究[J]. 營養學報, 2013, 35(6): 567-570.

[8] 陳禮儀, 田金舉, 任婧, 等. 植物花色苷對血小板凋亡通路中BCL2家族影響[J]. 中國公共衛生, 2014, 30(1): 67-69.

[9] HSIEH D P H, HUXTABLE S, NG K F, et al. Determination of interactions between human thrombopoietin and its receptor MPL by yeast two-hybrid system and affi nity biosensor[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2000, 32(5): 481-488.

[10] APOSTOLIDIS P A, WOULFE D S, CHAVEZ M, et al. Role of tumor suppressor p53 in megakaryopoiesis and platelet function[J]. Experimental Hematology, 2012, 40(2): 131-142.

[11] MACHLUS K R, ITALIANO J E. The incredible journey: from megakaryocyte development to platelet formation[J]. The Journal of Cell Biology, 2013, 201(6): 785-796.

[12] GREENBERG S M, ROSENTHAL D S, GREELEY T A, et al. Characterization of a new megakaryocytic cell line: the Dami cell[J]. Blood, 1988, 72(6): 1968-1977.

[13] DEUTSCH V R, TOMER A. Advances in megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis: from bench to bedside[J]. British Journal of Haematology, 2013, 161(6): 778-793.

[14] MAJKA M, BAJ-KRZYWORZEKA M, KIJOWSKI J, et al. in vitro expansion of human megakaryocytes as a tool for studying megakaryocytic development and function[J]. Platelets, 2001, 12(6): 325-332.

[15] 代燕平, 高小平, 吳建明, 等. 地榆總皂苷對巨核祖細胞增殖分化及相關受體表達的影響[J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(9): 1685-1689.

[16] 湯喜蘭, 黃立新, 曾治君, 等. 腫節風總黃酮對巨核系細胞體外擴增的作用研究[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(1): 79-82.

[17] 莫姝, 于潔, 楊默, 等. 當歸多糖與血小板源性生長因子, 血小板生成素對巨核細胞造血影響的比較研究[J]. 中華兒科雜志, 2008, 46(1): 45-48.

[18] KUTER D J. Milestones in understanding platelet production: a historical overview[J]. British Journal of Haematology, 2014, 165(2): 248-258.

[19] 趙永強. 第2代促血小板生成劑臨床研究現狀[J]. 內科理論與實踐, 2008, 3(2): 85-87.

[20] 王崧, 許楊, 王軍平, 等. TPO模擬肽類血小板生長因子研究進展[J].重慶醫學, 2010, 39(4): 477-479.

Effect of Cyanidin-3-O-β-Glucoside on the Proliferation and Differentiation of Human Megakaryocytic Cell Line Dami

REN Jing1,2, DENG Xiujuan1,2, WANG Yanyan1,2, ZHANG Like1,2, YA Fuli1,2, LU Minqi1, ZHANG Qing3, YANG Yan1,2,*
(1. School of Public Health, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food, Nutrition and Health, Guangzhou 510080, China; 3. School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

Purpose: To investigate the effects of cyanidin-3-O-β-glucoside (Cy-3-g) on the proliferation and differentiation of human megakaryocytes cell line (Dami). Methods: Megakaryocytes were cultured with or without different concentrations of Cy-3-g (0.05, 0.50, 5.00, 50.00 and 100.00 μmol/L). Cell viability and proliferation were respectively measured by typan blue staining and MTT test. Colony formation of megakaryocytes in soft agar medium from different groups was assayed. After culturing the cells from each group, giem sa staining was used to observe cell morphology. Polyploidy of megakaryocyte DNA and CD41 expression rate were tested by fl ow cytometry. Results: Cy-3-g at concentrations of 50.00 and 100.00 μmol/L effectively enhanced the viability of Dami cells when compared with the control group (P < 0.05). Dami cells treated with Cy-3-g showed higher cell proliferation than the cells from the control group (P < 0.01). Cy-3-g at 50.00 and 100.00 μmol/L signifi cantly increased the number of colony formation, DNA polyploidy and CD41 expression rate in Dami cells compared to the control group (all P < 0.01). Conclusion: Cy-3-g can promote the proliferation and differentiation of human megakaryocytes, which provides a potential theoretical basis for platelet production induced by anthocyanins.

cyanidin-3-O-β-glucoside; megakaryocyte; proliferation; differentiation

R151.41

A

1002-6630（2015）01-0196-05

10.7506/spkx1002-6630-201501037

2014-07-14

國家自然科學基金面上項目（81372978）；中山大學實驗室開放基金項目（KF201214）

任婧（1988—），女，碩士研究生，研究方向為營養與慢性非傳染病的預防。E-mail：1988.renjing@163.com

*通信作者：楊燕（1972—），女，教授，博士，研究方向為營養與慢性非傳染病的預防。E-mail：yangyan3@mail.sysu.edu.cn