殼寡糖對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

王 晗，米生權，孫雅煊，趙 卓，林 強

（北京聯合大學應用文理學院，北京 100191）

殼寡糖對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

王 晗，米生權，孫雅煊，趙 卓*，林 強

（北京聯合大學應用文理學院，北京 100191）

目的：探討不同質量濃度的殼寡糖延長秀麗隱桿線蟲壽命的活性功能，試圖尋求延緩衰老的生物活性物質。方法：以秀麗隱桿線蟲為模式生物，以線蟲壽命為指標，用相對分子質量≤1 000的殼寡糖（chitooligosaccharides，COS）設立對照組和殼寡糖4 個用藥組（50、100、200、400 mg/L），測定線蟲的壽命、生殖能力、移動速率和吞咽頻率。結果：與對照組比較，殼寡糖質量濃度達到200 mg/L以上時可使線蟲的壽命延長（P＜0.05），不同質量濃度的殼寡糖對線蟲平均壽命和最大壽命均具有延長作用。殼寡糖400 mg/L組延長壽命的效果最為明顯。與對照組比較，殼寡糖質量濃度在100 mg/L以上時線蟲的移動速率和吞咽頻率增加（P＜0.01），但當殼寡糖質量濃度為400 mg/L時，線蟲的移動速率和吞咽頻率的增加幅度趨緩。結論：相對分子質量≤1 000的殼寡糖在50～400 mg/L質量濃度范圍內能夠延長秀麗隱桿線蟲的壽命。

秀麗隱桿線蟲；模式生物；壽命；殼寡糖；抗衰老

從海洋生物中提取的殼聚糖具有多種生物活性，可以作為一種具有生物相容性和生物降解性的新型生物材料[1]，其水解產物殼寡糖（chitooligosaccharides，COS）不但有分子質量小，毒性低、水溶性好等特點，還起到增加人體免疫力、抑制腫瘤、調節血脂和血壓等功能[2]，同時還具有抗氧化[3]、神經保護[4]、抗腫瘤[5]、抗炎[6]、抗菌[7]、抗感染[8]等多種藥理作用，對細胞內過多的活性氧自由基具有一定的清除作用，同時對細胞接受外界刺激產生的氧化應激也能夠起到一定的保護作用[9-10]。盡管有研究表明，殼寡糖相關產品功能聲稱具有延緩衰老的特性，但很少有直接的證據支持殼寡糖能夠延長壽命。自1995年至今，在中國期刊網上僅有4 篇文獻以壽命為研究終點，明確指出殼寡糖具有延緩衰老的作用，其中1 篇為含有殼寡糖等多種成分產品的抗衰老研究（大豆異黃酮-殼聚糖-海藻酸鈉緩釋微囊的抗衰老能力的實驗研究），用殼聚糖-海藻酸鈉包埋體系制備大豆異黃酮緩釋微囊，評價緩釋微囊的抗衰老效應[11]。其余3 篇文章分別用小鼠和果蠅作為實驗對象，研究了殼寡糖的抗衰老作用，但壽命的終點研究均以果蠅為實驗對象[12-14]。本研究選用國際上公認的在延緩衰老研究領域中具有優勢的主要模式生物秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，簡稱線蟲）作為研究對象，以整體動物壽命實驗作為檢測手段[15]，以線蟲的平均壽命、生殖能力、移動速率和吞咽頻率作為切入點，研究不同質量濃度的殼寡糖對線蟲壽命的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

菌株E. coli OP50、野生型秀麗隱桿線蟲Bristol（N2）由北京生命科學研究所惠贈。

殼寡糖（相對分子質量≤1 000，可溶于水）由大連中科格萊克生物技術有限公司惠贈；5-氟尿嘧啶 美國Sigma公司；瓊脂粉 日本協和株式會社。

1.2 儀器與設備

MJ-250F-II霉菌培養箱 上海一恒科技有限公司；S6E體視顯微鏡 德國Leica公司；5804R離心機 德國Eppendorf公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 線蟲培養

線蟲的培養使用線蟲標準培養基（NGM）[16]，配制方法：每1 000 mL培養基含有瓊脂18～25 g，牛肉蛋白胨2.7 g，Tris-base 0.55 g，Tris-HCl 0.27 g，NaCl 2 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。給線蟲飼喂E. coli OP50，培養溫度為20 ℃。

1.3.2 線蟲同步化

用無菌水把成年的秀麗隱桿線蟲從NGM平板上沖洗至無菌的離心管中，1 200 r/min離心2 min，棄上清液，加入5 mL裂解液（每100 mL水中含有0.5 mol/L氫氧化鉀溶液10 mL，10%次氯酸鈉溶液10 mL，現用現配），室溫下充分振蕩溶液5 min直到線蟲破開，以M9緩沖液清洗蟲卵3 次。用M9緩沖液懸浮離心管底部蟲卵，滴在鋪有E. coli OP50的NGM平板上，于20 ℃培養箱中恒溫倒置培養約48 h，當受精卵發育為L4期幼蟲時用于壽命測定實驗。

1.3.3 線蟲壽命測定

配制線蟲壽命測定生長培養基NGM，對照組培養基中含有無菌去離子水，受試組培養基中殼寡糖的終質量濃度分別為50、100、200、400 mg/L，每個質量濃度設兩個平行。室溫放置過夜，將在37 ℃條件下培養16 h的E. coli OP50巴氏消毒法處理之后涂在測試用的NGM平板上，隨機挑取25 條同步化后的L4期幼蟲到各組NGM培養基上，于20 ℃培養箱中倒置培養。從轉移時刻起開始計算線蟲的存活天數，轉移當天記為壽命實驗的第0天，每2～3 d記錄線蟲存活數量，并將存活線蟲轉移至新鋪好的含有E. coli OP50菌液和相同質量濃度殼寡糖的NGM培養基上，實驗持續至最后一條線蟲死亡為止，以鉑金絲碰觸線蟲仍然不動即判定為死亡。依據線蟲生存、死亡的條數繪制生存曲線。

1.3.4 生殖能力測定

隨機挑取25 條同步化后的L4期幼蟲至殼寡糖終質量濃度分別為50、100、200、400 mg/L的NGM培養基上，同時設空白對照組，每組2 個平行。每48 h把線蟲轉移至新鋪含有E. coli OP50菌液和相同質量濃度殼寡糖的NGM培養基上，換下的舊板倒置于20 ℃培養24 h，記錄幼蟲數量，直到線蟲生殖能力喪失。將每天產生的子代數目相加即為線蟲終身產卵量。

1.3.5 移動速率測定

隨機挑取10 條同步化后的L4期幼蟲至殼寡糖終質量濃度分別為50、100、200、400 mg/L的NGM培養基上，同時設對照組，每組2 個平行。測定其移動速率，觀察時將線蟲挑至沒有食物的NGM平板上，先讓線蟲自由運動2 min，在顯微鏡下觀察并記錄1 min內線蟲的身體彎曲次數，作為身體彎曲頻率的指標。1 次彎曲定義為線蟲相對于身體長軸方向上的一個波長移動。

1.3.6 吞咽頻率測定

隨機挑取10 條同步化后的L4期幼蟲至殼寡糖終質量濃度分別為50、100、200、400 mg/L的NGM培養基上，同時設對照組，每組2 個平行。觀測其吞咽頻率，在顯微鏡下觀察并記錄1 min內線蟲的吞咽次數，作為線蟲吞咽頻率的指標。

1.4 統計學分析

采用SPSS統計分析軟件對線蟲壽命的實驗數據進行Kaplan-Meier法的生存分析，對線蟲壽命相關生理指標的數據進行One-Way ANOVA分析，相關性采用Spearman檢驗。

2 結果與分析

2.1 殼寡糖對線蟲壽命的影響

表1 不同質量濃度的殼寡糖對線蟲壽命的影響Table 1 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the lifespan of C. elegans

圖1 不 同質量濃度的殼寡糖對線蟲壽命的影響Fig.1 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the lifespan of C. elegans

經Kaplan-Meier生存分析得出（表1），對照組線蟲的平均壽命為32.2 d， 最大壽命為32 d；殼寡糖400 mg/L組線蟲的平均壽命和最大壽命最長。與對照組相比有統計學差異（P＜0.05）。線蟲的生存曲線如圖1所示，與對照組相比，50、100、200、400 mg/L殼寡糖均能使線蟲的生存曲線右移并延長線蟲的平均壽命，以殼寡糖400 mg/L組最為顯著。根據Spearman相關分析得出，殼寡糖50、100、200、400 mg/L組延緩線蟲衰老作用具有一定的劑量依賴性（P＜0.05），本實驗中400 mg/L組效果優于其他劑量組。

2.2 殼寡糖對線蟲生殖能力的影響

圖2 不同質量濃度的殼寡糖對線蟲生殖能力的影響Fig.2 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the reproductive capacity of C. elegans

經One-Way ANOVA分析得出，對照組線蟲平均產卵200 枚；殼寡糖50、100、200、400 mg/L組線蟲平均產卵分別為203、207、218、229 枚，與對照組相比，殼寡糖50、100、200、400 mg/L組的平均產卵數略高于對照組。如圖2所示，對照組線蟲的平均產卵量最少，殼寡糖400 mg/L組線蟲的平均產卵量最多。與對照組相比，殼寡糖各劑量組對線蟲的生殖能力均有影響，但影響程度不大。同時在顯微鏡下觀察到，高質量濃度殼寡糖組線蟲體內卵數量明顯增多，最后死亡時仍有大量卵未排出體外，而對照組卻無此現象出現。

2.3 殼寡糖對線蟲移動能力的影響

經One-Way ANOVA分析得出，對照組線蟲在1 min內的平均移動距離是4.8；殼寡糖50、100、200、400 mg/L組線蟲的平均移動距離分別為5.2、5.3、5.4、5.3，殼寡糖100、200、400 mg/L組與對照組相比有統計學差異（P＜0.01）。如圖3所示，1 min內對照組線蟲的平均移動距離最短，殼寡糖200 mg/L組線蟲的平均移動距離最長。與對照組相比，殼寡糖各劑量組對線蟲的移動能力均有影響，在50～200 mg/L質量濃度范圍內能提高線蟲的移動速率，但與200 mg/L組相比，400 mg/L的殼寡糖反而會導致線蟲的移動速率降低。

圖3 不同質量濃度的殼寡糖對線蟲移動速率的影響Fig.3 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the movement speed of C. elegans

2.4 殼寡糖對線蟲吞咽頻率的影響

圖4 不同質量濃度的殼寡糖對線蟲吞咽頻率的影響Fig.4 Effect of chitooligosaccharides with different concentrations on the swallowing frequency of C. elegans

經One-Way ANOVA分析得出，對照組線蟲在1 min內的吞咽頻率是80.9；殼寡糖50、100、200、400 mg/L組線蟲的平均吞咽頻率分別為83.0、84.3、85.6、82.5，殼寡糖50、100、200 mg/L組與對照組相比有統計學差異（P＜0.05或P＜0.01）。如圖4所示，1 min內對照組線蟲的吞咽頻率最低，殼寡糖200 mg/L組線蟲的吞咽頻率最高。與對照組相比，殼寡糖各劑量組對線蟲的吞咽頻率均有影響，50～200 mg/L質量濃度范圍內能提高線蟲的吞咽頻率，但與200 mg/L組相比，400 mg/L的殼寡糖會導致線蟲的吞咽頻率降低。

3 討 論

由于產卵數主要反映了秀麗線蟲的繁殖能力。因此，測定產卵數可以幫助研究殼寡糖對秀麗線蟲在繁殖能力方面所形成的延長壽命作用。移動速率和吞咽頻率是秀麗線蟲最基本的運動。運動行為常被作為反映神經系統基本功能的指標，也可以間接反應出線蟲壽命及生存狀態，檢測以上指標，操作和觀察較方便、實驗周期較短、實驗成本也較低[17]。本實驗發現殼寡糖一定質量濃度范圍內可延緩秀麗線蟲衰老，使用不同劑量的殼寡糖（50、100、200、400 mg/L）干預秀麗線蟲的衰老，結果表明在壽命方面，隨著殼寡糖質量濃度的升高，線蟲的平均壽命顯著延長，具有一定的促生殖峰期作用，其中400 mg/L的殼寡糖作用效果優于其他劑量。在生殖能力方面，隨著殼寡糖質量濃度的升高，線蟲的產卵量有一定程度的增加，但卵排出體外過程有受阻現象，對終身排卵數的影響不大，但實際產卵數明顯提高，并且在殼寡糖組均出現了線蟲體內有大量卵細胞滯留、生殖孔處膨出體外的現象，這可能是造成最后整體排卵數區別不大的原因。在移動能力和吞咽能力方面，殼寡糖在一定質量濃度范圍內能提高線蟲的移動速率和吞咽頻率，當殼寡糖的質量濃度超出一定范圍時，線蟲的移動速率和吞咽頻率又會有不同程度的下降，這可能是由于高質量濃度的殼寡糖會對線蟲機體產生一定的毒性作用，線蟲通過降低運動頻率來減少對有毒物質的吸收，從而保障其基本生存能力。

在壽命方面，有研究人員用川芎提取物[18]、白藜蘆醇[19]、青蒿素[20]、淫羊藿總黃酮[21]、香椿葉總黃酮[22]、大鯢粗提物[23]、百草枯[24]等藥物對線蟲壽命方面作了相關研究。在抗氧化方面，有研究人員以小鼠作為實驗對象研究殼寡糖的抗氧化作用，證明殼寡糖在小鼠體內能顯著降低脂質過氧化產物丙二醛（malondialdehyde，M D A）的含量，提高肝組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活力[25]；在體外可以清除超氧陰離子自由基及羥自由基，具有清除自由基及抗脂質過氧化的作用，是一種天然抗氧化劑[26]。通過采用電子自旋共振技術就殼寡糖對超氧陰離子自由基的抑制作用進行考察，證明不同分子質量的殼寡糖具有明顯的清除自由基，抑制其活性的效果[27]，這種抑制作用很可能與分子鏈中大量的活性羥基有關。不同分子質量的殼寡糖性質差異很大，有時甚至表現出截然相反的特性，因而在清除自由基的活性方面也就存在很大差異[28-29]，清除自由基的活性隨殼寡糖分子質量的減小而增強[30]，特別是低分子質量的殼寡糖表現出較高的清除自由基活性[31]。這為殼寡糖及其金屬配合物的進一步開發應用提供了理論依據，為進一步研究低分子質量殼寡糖的抗自由基活性研究提供了實驗基礎，從而在分子水平上的一個方面揭示了殼寡糖作為醫用保健品的機理[32]。本實驗以秀麗隱桿線蟲作為模式生物，以壽命作為研究指標，觀察殼寡糖對線蟲壽命的影響，發現多個質量濃度的殼寡糖對線蟲均有延長壽命作用或延長壽命趨勢，迄今為止還未見到有關殼寡糖這一藥理作用的報道。

由于殼寡糖的分子質量與其生物活性有密切關系，低分子質量殼寡糖含有大量的羥基和氨基，具有較好的水溶性和抗氧化活性，與同劑量的高分子質量殼寡糖相比，低分子質量殼寡糖顯示了更優的活性功能[33]。且目前對殼寡糖抗氧化活性的細胞學實驗中，相對分子質量主要集中在10 000以下，以3 000以下活性最好[34-35]。由于之前研究了寡聚糖1 000 mg/L以下線蟲的存活率，通過對LC50的測定，發現殼寡糖質量濃度≤500 mg/L時對線蟲的存活沒有影響，此外，其他用寡聚糖做細胞學實驗的適宜質量濃度范圍為50～125 mg/L[36]。因此本次實驗使用相對分子質量≤1 000的殼寡糖，研究殼寡糖活性與其在50～400 mg/L質量濃度范圍之間的關系，結果發現相對分子質量≤1 000的殼寡糖在50～400 mg/L范圍內具有一定延長線蟲壽命的功能，其機制可能與抗自由基的活性有關，但殼寡糖活性與相對分子質量之間的關系及其活性機制，以及高于400 mg/L的殼寡糖對線蟲壽命的影響等還有待進一步研究。

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Effect of Chitooligosaccharides on Lifespan of Caenorhabditis elegans

WANG Han, MI Shengquan, SUN Yaxuan, ZHAO Zhuo*, LIN Qiang
(College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To explore the lifespan-prolonging effect of chitooligosaccharides (COS) at various concentrations on Caenorhabditis elegans (C. elegans) in order for these compounds to be developed into anti-aging drugs. Methods: C. elegans as a model organism were cultured in the absence (control) or presence of different concentrations (50, 100, 200 and 400 mg/L) of COS with a relative molecular mass not greater than 1 000. The effects of COS on the li fespan, reproductive capacity, movement speed and swallowing frequency of C. elegans were examined. Results: Compared with the control group, the lifespan of C. elegans was prolonged by COS at concentrations larger than 200 mg/L (P < 0.05). COS at all investigated concentrations could signifi cantly extend the mean and maximum lifespan of C. elegans and 400 mg/L was the most effective concentration for prolonging the lifespan of C. elegans. Compared with the control group, the movement speed and swallowing frequency of C. elegans were increased when the concentration of COS was higher than 100 mg/L (P < 0.01), reaching a plateau at 400 mg/L. Conclusion: COS with relative molecular mass equal to or less than 1 000 at concentrations of 50–400 mg/L can signifi cantly improve the mean and maximum lifespan of C. elegans.

Caenorhabditis elegans; model organism; lifespan; chitooligosaccharides; anti-aging

R114

A

1002-6630（2015）01-0229-05

10.7506/spkx1002-6630-201501044

2014-10-10

北京市教育委員會科學研究項目（SQKM201311417014）；北京市屬市管高等學校人才強教計劃項目（PHR201107150）

王晗（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品毒理學。E-mail：wh900124@sina.com

*通信作者：趙卓（1963—），男，教授，博士，研究方向為食品毒理學。E-mail：zhaozhuo@buu.edu.cn