雷米普利與曲美他嗪對慢性心力衰竭大鼠腎臟細胞凋亡及細胞色素C的影響

張夢云，楊曉歐，彭玉娟，馮翔宇，李秀華

基礎與實驗研究

雷米普利與曲美他嗪對慢性心力衰竭大鼠腎臟細胞凋亡及細胞色素C的影響

張夢云，楊曉歐，彭玉娟，馮翔宇，李秀華

目的： 探討雷米普利與曲美他嗪單用及聯合應用對慢性心力衰竭（CHF）大鼠腎臟細胞凋亡及細胞色素C（Cyt-C）表達的影響。

方法： 采用腎上腹主動脈縮窄術復制CHF模型，將50只雄性Wistar 大鼠隨機分為假手術組、模型組、雷米普利組、曲美他嗪組和聯合用藥組（雷米普利+曲美他嗪），每組10只。利用TUNEL法檢測腎小管上皮細胞凋亡；逆轉錄聚合酶鏈反應法檢測Cyt-C mRNA 含量以及Western Blot法檢測腎臟細胞Cyt-C蛋白表達水平。

結果：與假手術組比較，模型組腎小管細胞凋亡指數（AI）、Cyt-C mRNA含量及蛋白表達量均顯著增加（P＜0.01），與模型組比較，雷米普利組、曲美他嗪組和聯合用藥組的腎小管AI[（20.02±1.14）%、（20.10±1.20）%、（14.27±1.40）% vs（ 40.82±1.31）%]、Cyt-C mRNA表達量 （ 0.54±0.06、0.56±0.05、0.44±0.04 vs 0.89±0.03）及蛋白表達水平顯著降低（1.50±0.11、1.58±0.12、0.75±0.06 vs 2.53±0.10），且以聯合用藥組降低最明顯，差異均有統計學意義（P＜O.01）。

結論：雷米普利與曲美他嗪均可抑制腎臟細胞凋亡，有效改善腎臟功能，聯合用藥對細胞凋亡的抑制作用優于單一用藥。

雷米普利；曲美他嗪；心力衰竭；細胞凋亡

Objective: To explore the effects of ramipril, trimetazidine and the combination of ramipril and trimetazidine on renal cell apoptosis index (AI) and cytochrome C (Cyt-C) expression in experimental rats with chronic heart failure (CHF).

Methods: CHF model was established by partially banding of abdominal aorta superior to renal artery in experimental rats. A total of 50 male Wistar rats were randomly divided into 5 groups: Sham operation group, Model group, Ramipril group, Trimetazidine group and Combination (ramipril and trimetazidine) group. n=10 in each group. Renal tubular cell AI was examined by TUNEL method, mRNA and protein expressions of Cyt-C were detected by RT-PCR and Western Blot analysis in each group respectively.

Results: Compared with Sham operation group, Model group had increased AI of renal tubular cells, increased mRNA and protein expressions of Cyt-C, P＜0.01. Compared with Model group, Ramipril group, Trimetazidine group and Combination group showed decreased AI of renal tubular cells (20.02 ± 1.14) %, (20.10 ± 1.2) % and (14.27 ± 1.40) % vs ( 40.82 ± 1.31) %; reduced Cyt-C mRNA expression (0.54 ± 0.06), ( 0.56 ± 0.05) and (0.44 ± 0.04) vs (0.89 ± 0.03); reduced Cyt-C protein expression (1.50 ± 0.11), (1.58 ± 0.12) and (0.75 ± 0.06) vs (2.53 ± 0.10); the most reduction was obtain by Combination group, all P＜0.01.

Conclusion: Ramipril and trimetazidine can inhibit renal cell apoptosis and effectively improve the renal function in CHFrats. Combined medication is better than either of them alone.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1208.)

近年來，隨著慢性心力衰竭（CHF）發病率和死亡率的上升，腎功能不全發病率也逐年增高，并且腎功能損害是影響CHF患者病死率上升的獨立因素。線粒體外膜通透性的改變在細胞凋亡中扮演著非常重要的角色，通透性的改變導致凋亡蛋白細胞色素C(Cyt-C)釋放至胞漿，激活下游的caspase酶，引起細胞凋亡發生[1]。血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI )類藥物——雷米普利（RAM）最初僅用于治療高血壓，但臨床研究發現有更多臨床適應癥：腎臟疾病、CHF和心血管疾病預防。曲美他嗪（TMZ）屬于哌嗪類衍生物藥物，是線粒體酶一長鏈3-酮酰輔酶A硫解酶(3-KAT)抑制劑，具有優化細胞能量代謝，減輕氧化應激，抑制活性氧自由基生成與釋放，減少胞膜脂質氧化反應，在抑制細胞凋亡方面有一定作用[2]。

本實驗通過觀察CHF大鼠腎臟組織細胞凋亡情況及Cyt-C的表達，以探索兩種藥物在治療CHF引起的腎臟損害療效方面是否相似，以及聯合用藥的療效是否更佳。

1　材料與方法

材料與試劑 :2014-01至2014-10選擇50只清潔級雄性Wistar大鼠（北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證編號：2009-0004）。鹽酸曲美他嗪（瑞陽制藥有限公司）；雷米普利（昆山龍燈瑞迪制藥有限公司）；TUNEL試劑盒[美國羅氏（Roche）公司]; Cyt-C引物（美國Invitrogen公司）；逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；Trizol(美國Invitrogen公司)；Cyt-C兔抗多克隆抗體（武漢博士得公司）；組織裂解液（貝博科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Super ECL Plus 超敏發光液（美國Thermo公司）。

方法:（1）動物模型的建立、分組 ： 全部大鼠經1周適應性喂養后，隨機抽取10只作為假手術組，假手術組大鼠只分離腹主動脈，不予結扎，其余大鼠均采用腎上腹主動脈縮窄術復制CHF模型[3]。將造模成功的Wistar大鼠隨機分為模型組、雷米普利組、曲美他嗪組和聯合用藥組（雷米普利＋曲美他嗪），每組各10只。術后大鼠給予20萬U青霉素連續3 d腹腔注射，并常規喂養4周，大鼠逐漸出現呼吸和心跳加快、反應遲鈍、食欲減退等表現。經血流動力學參數檢測：左心室舒張末壓（IVEDP）≥15 mm Hg（1 mmHg＝0.133 kPa）標志CHF模型復制成功。雷米普利組給予雷米普利1 mg/（kg·d），曲美他嗪組給予曲美他嗪10 mg/（kg·d），聯合用藥組給予雷米普利1mg/（kg·d）＋曲美他嗪10 mg/（kg·d），均灌胃給藥4周，假手術組及模型組給予等量生理鹽水灌胃相同時間[4]。（2）細胞凋亡指數(AI)的檢測：采用原位末端轉移酶標記法(TUNEL法)檢測腎臟細胞凋亡情況，石蠟組織切片脫蠟至水，采用PBS緩沖液(濃度為0.01 M，由90 g Nacl、29 g Na2HPO4·12 H2O和2.9 g NaH2PO4·2 H2O溶于1000 ml蒸餾水中，調PH值至7.2～7.4)洗5 min，加入胰蛋白酶去除組織蛋白，PBS緩沖液洗10 min，玻片干后滴加50 μl由50 μl脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）和450 μl熒光素標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）混合的反應液，陰性對照僅加50 μl熒光素標記的dUTP液，37℃反應1 h，采用熒光顯微鏡進行觀察凋亡情況并計數，被激發出綠色熒光的細胞核為陽性細胞核，每個標本隨機選取10個視野觀察，分別對細胞總數和細胞凋亡核數進行計數并求其平均值，通過公式AI=凋亡細胞核數/總細胞核數×100%，計算腎臟AI。（3）RT-PCR檢測Cyt-C mRNA表達：將新鮮腎臟組織從-80℃取出置于冰上解凍，按100 mg組織中加1 ml Trizol比例在勻漿器中進行研磨，離心，加氯仿、異丙醇和焦炭酸二乙酯（DEPC）水，使用紫外分光光度計法對提取的總RNA的純度和濃度進行測量。Cyt-C的引物序列，上游引物：5’-CCTTTGTGGTGTTGACCAGC-3’；下游引物：5’-CCATGGAGGTTTGGTCCAGT-3’,擴增片段為140 bp，退火溫度為50.5℃；β-肌動蛋白(β-actin)引物作為內參照，上游引物：5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’；下游引物：5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA -3’，擴增片段為452 bp，退火溫度為57℃。使用2%瓊脂糖凝膠進行PCR產物電泳，使用Gel Plus統計軟件進行定量分析，以各組Cyt-C吸光度（A）與其對應的內參照β-actin(A)的比值表示目的基因表達水平。（4）蛋白質免疫印跡（Western Blot）法檢測Cyt-C蛋白:按照組織裂解液與蛋白定量試劑盒說明書準確提取各組大鼠腎臟總蛋白并測量蛋白濃度[5]，在95℃的水浴鍋中將與Buffer按比例混勻的蛋白煮5 min變性，用20 μg質量上樣，Cyt-C一抗濃度為1：200，二抗濃度為1：2000，β-actin的一抗濃度為1：1000，二抗濃度為1：2000，采用增強化學發光法(ECL)進行檢測，顯影。將膠片進行掃描處理，采用Gel Plus凝膠分析軟件對顯影條帶進行分析，測定蛋白條帶的吸光度值，以目的條帶與內參照條帶的吸光度的比值進行各組目的蛋白表達含量的比較。

2　結果

各組大鼠腎臟AI：圖中綠色熒光的細胞核為凋亡細胞核，綠色熒光細胞核越多說明細胞凋亡的越多。假手術組幾乎不存在凋亡細胞；與假手術組比較，模型組中凋亡的細胞數顯著增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，雷米普利組、曲美他嗪組和聯合用藥組中凋亡細胞數量明顯減少，聯合用藥組降低最顯著，差異均有統計學意義（P＜0.01）；雷米普利組與曲美他嗪組比較，差異無統計學意義（圖1，表1）。

圖1　TUNEI法檢測各組大鼠腎組織細胞凋亡的變化 (×200)

表1　各組大鼠腎臟AI、Cyt-C mRNA及Cyt-C蛋白表達的比較

表1　各組大鼠腎臟AI、Cyt-C mRNA及Cyt-C蛋白表達的比較

注：Cyt-C mRNA表達水平為各組大鼠Cyt-C mRNA與相應β-actin吸光度的比值；Cyt-C蛋白表達水平為各組大鼠Cyt-C蛋白與相應β-actin吸光度的比值；AI:細胞凋亡指數；Cyt-C：細胞色素C；β-actin：β-肌動蛋白。與假手術組相比*P＜0.01;與模型組相比△P＜0.01;與雷米普利組相比▲P＜0.01;與曲美他嗪組相比#P＜0.01

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各組大鼠腎臟組織Cyt-C mRNA表達:與假手術組比較:模型組Cyt-C mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較：雷米普利組、曲美他嗪組和聯合用藥組Cyt-C mRNA表達均有所降低，以聯合用藥組下降最明顯，差異有統計學意義（P＜0.01），雷米普利組與曲美他嗪組比較，差異無統計學意義（圖2，表1）。

各組大鼠腎臟組織Cyt-C蛋白表達的比較：與假手術組比較：模型組Cyt-C蛋白平均吸光度值明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，雷米普利組、曲美他嗪組和聯合用藥組Cyt-C蛋白平均吸光度值均降低，其中以聯合用藥組降低最顯著，差異有統計學意義（P＜0.01），雷米普利組與曲美他嗪組比較，差異無統計學意義（圖3，表1）。

圖2　RT-PCR法檢測各組大鼠腎組織Cyt-C mRNA表達

圖3　蛋白印跡檢測各組大鼠腎組織Cyt-C蛋白的表達

3　討論

心臟與腎臟擁有很多相似病理作用機制且二者關系十分密切，因此CHF常常伴有腎臟功能和結構的損害，并且還進一步加重心功能的惡化[6]。有研究表明腎臟在CHF早期可能存在腎小管細胞凋亡。CHF時由于腎臟灌注不足而處于缺血狀態，能量代謝發生障礙，氧化應激反應增強、氧自由基生成增多和線粒體外膜受損是細胞凋亡的重要誘導因素[7]。

內源性線粒體凋亡途徑在腎臟疾病中發揮十分重要作用，細胞的丟失是腎功能不全發生的一個重要病理生理基礎[8]。線粒體在缺血缺氧、氧化應激、細胞鈣超載等病理條件下，線粒體腫脹，外膜結構破壞，導致膜上的通透性轉換孔(MPTP)開放，線粒體Cyt-C釋放至胞漿[1,9]。Cyt-C定位于線粒體內膜上，為線粒體呼吸鏈的重要組成部分，線粒體膜間隙內缺乏Cyt-C會中斷呼吸鏈的電子傳遞，ATP生成減少，能量缺失也可導致細胞凋亡。

國外有研究表明，氧化應激是腎臟疾病重要的病理生理機制，應用抗氧化劑對于腎臟疾病的治療是有效的[10]。雷米普利屬于ACEI類藥物，通過有效抑制RAS系統中Ang II的生成，起到抗缺血抗氧化應激從而對腎臟具有保護作用[11]。因此有針對性地改善細胞能量代謝、抑制氧自由基產生、減少氧化應激反應可以改善腎臟缺血時細胞凋亡。曲美他嗪是一種新型獨特的細胞保護劑，屬于哌嗪類衍生物。曲美他嗪對缺血細胞的作用可能是直接的細胞保護作用，通過改善缺血細胞內的能量代謝，減少細胞內H+、Na+和Ca2+的超負荷，抑制氧自由基的生成，提高氧自由基的清除功能[12]。曲美他嗪可能具有抗細胞凋亡的作用[13]。1989年Aubert證實了曲美他嗪具有抗氧化特性。在缺氧狀況下，線粒體內Ca2+超負荷可引起線粒體腫脹，氧化磷酸化障礙，曲美他嗪可與膜上的可通透性蛋白結合并使之失活以抑制Ca2+引起的線粒體腫脹，從而減少Cyt-C 釋放，抑制caspase-3 活化，阻止細胞凋亡[4]。曲美他嗪曾多次被研究證明具有強大的抗氧化作用，可以抑制氧自由基的過度釋放，減少細胞膜的脂質氧化[14]。

在本動物實驗中顯示，與假手術組相比，模型組的AI值明顯升高，說明CHF大鼠的腎小管細胞存在明顯的凋亡。藥物干預后用藥組AI值均有所下降，且聯合用藥組AI值下降最明顯，說明雷米普利與曲美他嗪均可以抑制腎臟細胞凋亡，兩者聯合用藥具有協同作用。RT-PCR與Western Blot 對Cyt-C檢測的實驗結果與AI的趨勢保持一致，進一步說明CHF大鼠腎功能損害與細胞凋亡密切相關。

本實驗結果說明了細胞凋亡是CHF大鼠腎功能不全的病理基礎；雷米普利與曲美他嗪對腎功能的保護機制是減少氧化應激所誘導的細胞凋亡，改善腎臟功能，延緩腎功能衰竭，且聯合用藥療效優于單一用藥，且很可能與Cyt-C過表達和大量釋放有關。為臨床治療CHF引起的腎功能損害提供了實驗依據。聯合用藥對腎臟細胞凋亡的抑制作用最佳，其詳細的作用機制，仍需進一步研究。

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（編輯：汪碧蓉）

Effect of Ramipril and Trimetazidine on Renal Cell Apoptosis and Cytochrome C Expression in Experimental Rats With Chronic Heart Failure

ZHANG Meng-yun,YANG Xiao-ou, PENG Yu-juan, FENG Xiang-yu, LI Xiu-hua.
Department of Geriatrics, Affliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde (067000), Hebei, China
Corresponding Author: LI Xiu-hua, Email: lixiuhua76@126.com

Ramipril; Trimetazidine; Heart Failure; Apoptosis

河北省衛生計生委資助項目(20110180)

067000 河北省承德市，承德醫學院附屬醫院 老年病科(張夢云、楊曉歐、李秀華)；山東省泰安市，第一人民醫院 心內科(彭玉娟)；河北省，滄州市人民醫院 心內科(馮翔宇)

張夢云 碩士研究生 主要從事慢性心力衰竭的病理生理研究 Email:15632495589@163.com 通訊作者：李秀華 Email:lixiuhua76@126.com

R541.6

A

1000-3614（2015）12-1208-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.12.018

（2015-03-25）