丙泊酚對帕金森小鼠黑質多巴胺能神經元凋亡的影響

余志陽，潘士勇，劉清珍，劉 健，陳春龍，李偉彥，朱四海

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是以中腦黑質多巴胺能神經元進行性變性、缺失，導致黑質紋狀體多巴胺能神經系統失調而引發的中樞神經系統退行性疾?。?］。PD的發病機理復雜，“氧化應激傷學說”得到公認，即自由基通過氧化神經膜類脂、破壞多巴胺能神經元膜功能或直接破壞細胞DNA，最終導致多巴胺能神經元的凋亡［2-3］。目前丙泊酚腦保護研究多限于缺血再灌注后或缺血再灌注預處理方面［4-5］，而關于丙泊酚對PD患者多巴胺能神經元凋亡的影響較少研究。本研究通過小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)構建 PD 模型、丙泊酚干預、檢測黑質中相關蛋白表達水平，測定凋亡細胞，探討丙泊酚對PD小鼠多巴胺能神經元凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 經南京軍區南京總醫院動物醫學倫理會批準，健康雄性C57BL6小鼠48只，體重25～30 g，出生36～40周，由南京軍區南京總醫院動物實驗中心提供。飼養條件:維持室溫(25±2)℃，人工晝夜循環光照節律(12～12 h)，自由進食及飲水。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 C57BL6雄性小鼠48只，實驗動物隨機分為6組。Ⅰ組(n=8):腹腔注射等滲鹽水3 mL/kg，1次/d，連續5 d。Ⅱ組(n=8):腹腔注射 MPTP(Sigma，USA)30 mg/kg，1 次/d，連續5 d。Ⅲ組(n=8):最后一次注射MPTP后2 h，腹腔注射脂肪乳(Sino-Swed Pharmaceutical Corp，China)10 mL/kg。Ⅳ組(n=8):最后一次注射MPTP后24 h，腹腔注射脂肪乳10 mL/kg。Ⅴ組(n=8):最后一次注射MPTP后2 h腹腔注射丙泊酚(Astrazeneca，Italy)100 mg/kg。Ⅵ組(n=8):最后一次注射MPTP后24 h腹腔注射丙泊酚100 mg/kg。

1.2.2 標本采集 最后一次腹腔注射藥物后12 h將每組4只小鼠麻醉，經左心室等滲鹽水灌洗后，再用含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PBS)灌注固定，迅速開顱取腦。石蠟包埋，切取中腦黑質區，切片厚度為 5 μm。

1.2.3 免疫組化染色 每組小鼠中隨機取4只進行免疫組化染色。切片脫蠟后，用TBS(pH 7.4)洗3次，每次10 min。切片進行水浴法抗原修復后降至室溫;TBS洗3次，每次10 min;加H2O2阻斷內源性過氧化物酶，TBS洗3次，每次10 min。分別采用兔抗小鼠 Bcl-2、Caspase-3多克隆抗體(1∶200，Cell Signaling Technology，USA)加入稀釋的羊抗兔IgGHRP，室溫溫育 1 h，PBS(pH 7.4)漂洗 5 min，共 3次。滴加DAB顯色液顯色10 min，蒸餾水沖洗、復染、脫水、封片。

1.2.4 免疫蛋白印跡(Western blot) 每組剩余4只小鼠進行免疫蛋白印跡分析。小鼠麻醉后取中腦黑質部分，置入組織蛋白提取液中，低溫勻漿，取出上清液。蛋白定量后取30 μg樣品，經8%SDS凝膠電泳后，轉移至硝酸纖維膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h后，取相應條帶分別加入Bcl-2兔抗小鼠一抗(1∶1000，Cell Signaling Technology，USA)，Caspase-3兔抗小鼠一抗(1∶1000，Cell Signaling Technology，USA)，4℃孵育過夜，TBST清洗3次，每次5 min，加 HRP 標記的羊抗兔二抗(1∶1000，Sigma，USA)，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。暗室內加ECL顯影液顯色曝光，掃描。內參為 β-actin(1∶1000，Cell Signaling Technology，USA)。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化 Ⅰ組小鼠黑質可見大量神經元(圖1A)，排列整齊呈條帶狀。Ⅱ組和對照組比較，黑質區神經元明顯減少(圖1B)。Ⅴ、Ⅵ組與Ⅱ組比較，神經元明顯增多(圖1B、E、F)，但Ⅲ、Ⅳ組與Ⅱ組比較，黑質區神經元減少無差異(圖1B、C、D)。

圖1 6組小鼠黑質區多巴胺能神經元免疫組化染色結果(×200)

2.2 Western blot檢測 PD模型組小鼠黑質區Caspase-3蛋白含量最高(圖2)。丙泊酚24 h干預組小鼠黑質區Bcl-2蛋白的含量最高(圖3)。

圖2 6組小鼠黑質區Caspase-3蛋白的含量

圖3 6組小鼠黑質區Bcl-2蛋白的含量

3 討論

PD是發生于中年以上的中樞神經系統進行性退行性疾病，其主要病理改變為黑質致密部多巴胺能神經元變性和壞死，流行病學研究顯示該病為老年性癡呆(Alzheimer’s disease)以外第二多見的神經退行性病變［6］。隨著人口老年化，接受外科手術的老年患者逐年增加，這意味著越來越多的PD患者亦接受手術麻醉。為了選擇有利于PD患者的麻醉藥物，本研究探討了常用的靜脈麻醉藥丙泊酚對PD模型小鼠黑質神經元凋亡的影響，發現①丙泊酚減輕MPTP誘導帕金森小鼠黑質區組織學的改變，減少凋亡細胞的產生;②丙泊酚可抑制帕金森小鼠黑質凋亡蛋白Caspase-3的表達，同時上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。

PD發病機制至今尚未完全闡明，普遍認為線粒體DNA的突變和氧化應激是主要致病因素［7］。MPTP可成功誘導小鼠PD模型［8］，其機理可能為氧化應激造成的線粒體復合酶的功能抑制［2］，引起細胞色素C釋放，激活Caspase-3引起凋亡的產生［9-10］。Caspase-3和Bcl-2在細胞凋亡過程中起主要作用，Bcl-2和前凋亡蛋白Bax聚合為復合體，降低Bax活性，抑制凋亡的發生［11-12］。研究表明PD患者黑質區蛋白存在自由基調節損傷機制，自由基調節損傷可激活前凋亡蛋白Bax，同時還可破壞線粒體DNA(mtDNA)，進一步加重 PD 癥狀［13-14］。而抑制Caspse-3蛋白的表達可以減輕黑質神經元凋亡［15］。

丙泊酚作為靜脈麻醉藥物廣泛使用于臨床麻醉及重癥監護患者的鎮靜治療，研究表明丙泊酚可通過清除自由基、降低脂質過氧化作用、抑制凋亡蛋白的產生，而產生腦保護作用［4，16］。丙泊酚的腦保護作用還表現為減少缺血再灌注后腦梗死面積［17］。此外研究顯示丙泊酚對MPTP誘導的PD小鼠多巴胺能神經元產生保護作用，其機理是通過抑制環氧化酶(COX)蛋白表達來實現［17］。因此，在本研究中我們假設氧化應激在PD病程發展中具有重要作用［7］，丙泊酚具有抗氧化、抑制凋亡蛋白表達等腦保護作用，對MPTP誘導的PD小鼠黑質神經元亦具保護作用。

本研究中，在MPTP誘導的小鼠帕金森模型中，免疫組化顯示黑質區多巴胺能神經元凋亡細胞增加，經丙泊酚干預后多巴胺能神經元凋亡細胞減少，說明丙泊酚具有抗凋亡作用。丙泊酚處理后的MPTP小鼠，免疫組化及Western blot顯示Bcl-2表達增加，而Bcl-2具有抗凋亡作用，可抑制脂質過氧化［16］，表明丙泊酚抑制PD小鼠黑質區神經元凋亡可能通過抑制氧化應激實現的。Wang等［17］認為丙泊酚腦保護并不存在劑量依賴性，而Gelb等［18］認為鎮靜劑量的丙泊酚不產生腦保護作用。本研究中丙泊酚劑量100 mg/kg，PD小鼠接受腹腔注射后2 min后肢體反射消失，但呼吸存在，30 min后可恢復處理前狀態，這與Kozue等［19］認為100 mg/kg丙泊酚腹腔注射可提供MPTP誘導PD小鼠中等麻醉深度結果一致。

本研究還觀察了模型建立后2 h和24 h給予丙泊酚對黑質神經元凋亡的影響，發現24 h后給予丙泊酚顯示出更好的抗凋亡作用，這可能與MPTP誘導的黑質神經元凋亡的時程相關，即模型建立后24 h時神經元的凋亡較2 h時更顯著，此時給予丙泊酚顯示更明顯的抗凋亡效果，其機制需要進一步研究。此外，相關研究認為通過連續5次腹腔注射MPTP可以構建穩定的小鼠亞急性PD模型［20］，故本研究中小鼠PD模型制備后未施行為學檢測。

綜上所述，丙泊酚可減輕MPTP誘導的小鼠黑質神經元的凋亡，該效應可能與其抑制Caspase-3活性、促進Bcl-2作用有關。

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