復方風柜斗草對小鼠急性肝損傷的保護作用

陳美惠，石鶴坤，侯中華，陳開杰，林小鳳，王曙東，陳錦珊

復方風柜斗草由中藥風柜斗草和向天盞組成［1］，風柜斗草(Sarcopyramis nepalensis Wall)又名肉穗草、風鼓斗草，來源于野牡丹科植物肉穗草屬楮頭紅的全草，其性平、味甘，具有涼熱解毒、涼血利水、去肝火、清肺熱的功效，用于急性肝炎、肺熱咳嗽、風濕痹痛、耳鳴耳聾及目霧羞明等治療。廖梅等［2］報道風柜斗草的正丁醇提取部分具有抑制四氯化碳(CCl4)所致肝損傷所引起的轉氨酶升高的作用。向天盞(Scutellaria indica L.)又名韓信草、大力草、耳挖草(《生草藥性備要》)、金茶匙(《本草求原》)、順經草(貴州)、大葉半枝蓮(廣西)、虎咬癀(福建)，為唇形科植物向天盞的全草，主要分布于江南各省區，其味辛、微苦、性涼，歸肺、肝經，有清熱解毒、利水消腫、止痛的功效［3］。本實驗采用以上兩藥合用，探討其保護小鼠急性肝損傷的作用，為進一步研究該藥提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物 復方風柜斗草醇提取物，由南京軍區南京總醫院制劑科提供(批號:20140620)，聯苯雙酯滴丸(浙江萬邦藥業股份有限公司，批號:A02130212)。

1.2 試劑 丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測定試劑盒、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)測定試劑盒、總膽紅素(T-BIL)測定試劑盒、直接膽紅素(D-BIL)測定試劑盒購于上海復星長征醫學科學有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。CCl4購于天津市福晨化學試劑有限公司，羧甲基纖維素鈉(CMCNa)購于西隴化工股份有限公司，冰乙酸為天津市福晨化學試劑有限公司生產，無水乙醇為廣東光華科技股份有限公司生產，以上試劑均為分析純。大豆油購于中糧東州糧食工業(廣州)有限公司。

1.3 儀器 ADVIA2400全自動生化分析儀(德國西門子公司)、UV-2550紫外分光光度計(日本島津公司)、Pico-17高速離心機(美國賽默飛世爾公司)、BS223S電子天平(德國賽多利斯集團公司)、Model 680酶標儀(美國伯樂生命醫學有限公司)、MS3 digital震搖器(德國IKA工業公司)、420-A型恒溫水浴箱(姜堰市新康醫療器械有限公司)。

1.4 實驗動物 健康清潔級ICR種小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供［許可證號:SCXK(滬)2012-0002］，動物實驗環境及設施符合《中華人民共和國實驗動物規范》(GB14925-95)。動物實驗在廈門大學附屬東南醫院實驗室進行［許可證號:SYXK(軍)2012-0054］，符合倫理準則，獲得實驗動物倫理委員會批準，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。試驗前適應性飼養3 d，自由攝食飲水。

2 方法

2.1 分組與給藥 ICR種小鼠60只，隨機分為空白組、CCl4模型組、復方風柜斗草低劑量組、中劑量組、高劑量組、聯苯雙酯陽性對照組，每組10只，雌雄各半。復方風柜斗草給藥的高劑量為8.8 g/kg生藥，中劑量4.4 g/kg生藥、低劑量2.2 g/kg生藥;陽性對照組給藥劑量為0.2 g/kg，灌胃給藥體積0.4 mL/10 g，1次/d，連續給藥10 d;空白對照組和模型組給予1%羧甲基纖維素鈉CMC-Na水溶液。

2.2 造模與取材測定 末次給藥后0.5 h，除空白對照組腹腔注射等量大豆油外，其余各組小鼠腹腔注射0.1%CCl4大豆油溶液(0.1 mL/10 g體重)，制備CCl4急性肝損傷模型。24 h后，各組小鼠稱體重，摘眼球取血，靜置1 h，離心半徑15 cm，3500 r/min離心10 min后分離血清，嚴格按試劑盒說明書檢測T-BIL、D-BIL、ALT及AST活性。小鼠處死后，立即取肝臟于預冷等滲鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱定質量，計算肝臟指數［4］，并稱取0.8～1 g，加入9倍量預冷等滲鹽水制成10%肝組織勻漿，勻漿液以4000 r/min(離心半徑15 cm)離心10 min，取上清液，測定SOD活性和MDA的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

2.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，T-BIL、D-BIL、ALT、AST、MDA、SOD 等實驗數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較使用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 復方風柜斗草對CCl4所致肝損傷小鼠血清T-BIL、D-BIL、ALT和AST的影響 與空白組比較，模型組血清 T-BIL顯著增加(P＜0.05)，D-BIL、ALT、AST亦顯著增加(P＜0.01)，說明急性肝損傷模型造模成功。與CCl4模型組比較，復方風柜斗草中、高劑量組、聯苯雙酯組小鼠血清 T-BIL、D-BIL、ALT、AST明顯降低(P＜0.05或0.01)。見表1。

3.2 復方風柜斗草對CCl4所致肝損傷小鼠肝組織中MDA含量及SOD活性的影響 CCl4模型組與空白組比較，肝組織中MDA含量升高(P＜0.01)，SOD活性降低(P＜0.05)。與CCl4模型組比較，復方風柜斗草中、高劑量組、聯苯雙酯組可降低肝損傷小鼠肝組織中MDA含量，提高SOD活性(P＜0.05或0.01)。見表2。

表1 復方風柜斗草對小鼠急性肝損傷肝血清T-BIL、D-BIL、ALT和AST的影響(±s)

表1 復方風柜斗草對小鼠急性肝損傷肝血清T-BIL、D-BIL、ALT和AST的影響(±s)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n 劑量(g/kg) T-BIL(μmol/L)D-BIL(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)空白組 10 － 1.16±0.28 0.55±0.14 34.75±3.56 94.73±19.17 CCl4模型組 10 － 1.67 ±0.58* 0.81±0.21＊＊ 88.72±39.25＊＊ 166.49 ±49.37＊＊低劑量組 10 2.2 1.34 ±0.36* 0.67 ±0.15＊＊ 60.83 ±32.76* 137.14 ±35.39*中劑量組 10 4.4 1.21 ±0.21* 0.57 ±0.12＊＊ 53.22 ±20.61* 125.10 ±30.75*高劑量組 10 8.8 1.21 ±0.32* 0.53 ±0.18＊＊ 46.98 ±15.27* 121.14 ±27.18*聯苯雙酯組 10 0.2 0.91 ±0.12＊＊ 0.48 ±0.13＊＊ 44.38 ±25.50＊＊ 123.97 ±30.40*

表2 復方風柜斗草對小鼠急性肝損傷肝組織中MDA水平及SOD活性影響(±s)

表2 復方風柜斗草對小鼠急性肝損傷肝組織中MDA水平及SOD活性影響(±s)

注:與空白組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與 CCl4模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

組別 n 劑量(g/kg)MDA(nmol/mL)SOD(U/mg)空白組10 － 51.82 ±16.15 159.79 ±76.99 CCl4模型組 10 － 85.38±22.94 ＊＊ 92.08±54.02*低劑量組 10 2.2 68.53 ±13.62▲ 148.17 ±58.62▲中劑量組 10 4.4 60.56 ±12.04▲▲ 150.06 ±67.49▲高劑量組 10 8.8 56.92 ±10.13▲▲ 177.98 ±53.46▲▲聯苯雙酯組 10 0.2 68.32±17.49▲ 175.71±84.79▲

3.3 復方風柜斗草對小鼠體重及肝臟指數的影響在10 d的給藥期間內，高劑量組小鼠的體重增加最多，均值達到28.93 g，其次為聯苯雙酯組，見表3。復方風柜斗草對CCl4所致肝損傷小鼠肝臟指數的影響，各組之間比較差異無統計學意義(P＞0.05);但與空白組比較，各組小鼠的肝臟均有不同程度的腫脹，各給藥組均不能降低CCl4所致急性肝腫脹。

表3 復方風柜斗草對小鼠體重及肝臟指數的影響

4 討論

肝臟氧化損傷可引發多種疾病或加重機體的病變。CCl4是一種經典的誘發急性肝損傷的肝毒性藥物，選用0.1%CCl4大豆油作為造模材料，可以得到肝損傷程度合理、統計結果誤差較小的CCl4小鼠急性肝損傷模型［5-7］。本實驗采用0.1%CCl4大豆油(0.1 mL/10 g體重)灌胃，與空白對照組比較，模型組血清T-BIL、D-BIL、ALT、AST水平均顯著增加，說明急性肝損傷造模成功。

CCl4進入體內，經肝微粒體細胞色素P450作用下代謝為CCl3，并攻擊肝細胞膜上的磷脂分子，引起膜的脂質過氧化反應以及直接的膜溶解作用，導致肝細胞變性壞死或肝細胞通透性增強，進而引起血清中的 ALT、AST、T-BID、D-BID 含量上升［8-9］。SOD是體內清除自由基、抑制自由基反應的物質基礎之一，其活性降低則會導致體內氧自由基積累，引發質膜的過氧化作用，使膜結構破壞與功能受到損傷。MDA是氧自由基攻擊生物膜結構中的多聚不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應生成的，是脂質過氧化反應的最終產物［10-11］。小鼠腹腔注射CCl4導致急性肝損傷時，過量的氧自由基產生于肝組織細胞可引起SOD水平下降及MDA含量升高，通過檢測小鼠肝勻漿中的SOD活性及MDA含量可間接反映出藥物對肝細胞的保護作用［12-13］。

本實驗顯示，復方風柜斗草醇提物的高、中劑量組與聯苯雙酯對照組可顯著降低CCl4引起急性肝損害小鼠血清中的ALT、AST、T-BIL、D-BIL的含量，并提高肝勻漿組織中的 SOD活性，降低組織中MDA含量，且復方風柜斗草高劑量組各項指標與聯苯雙酯對照組接近。在小鼠體重方面，高劑量組體重均數比空白組增加2.53 g，其次為聯苯雙酯組增加1.91 g，說明復方風柜斗草對提高小鼠體質量具有一定的作用。與模型組比較，各給藥組小鼠在肝臟指數方面并未見降低，說明各給藥組小鼠不能降低由于CCl4引起的肝臟腫脹，其原因可能是CCl4引起損傷的早期，肝小葉結構被破壞，肝細胞不同程度腫脹未能及時修復而導致肝臟指數的增加。

綜上所述，復方風柜斗草具有保肝和對抗CCl4引起急性肝損傷的作用，其機制可能與復方風柜斗草所具有抗脂質過氧化和清除體內過多的氧自由基的作用有關，本研究為臨床應用復方風柜斗草治療急性肝損傷提供了理論參考。

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