UFLC法測定蛇足石杉不同部位的石杉堿甲含量

張方方，鄭雅媗，黃小強(qiáng)，諶賽男，吳水生

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

石杉堿甲是20世紀(jì)80年代我國學(xué)者從蛇足石杉中分離得到的一種新型石松類生物堿，被廣泛用于治療阿爾茨海默癥、重癥肌無力，同時又能促智、提高青春期學(xué)生的學(xué)習(xí)記憶功能［1］。目前測定蛇足石杉不同部位提取物中生物堿含量的方法主要為反相高效液相色譜法（R P－HP L C）［2］，尚無超高效液相或超快速液相檢測蛇足石杉中石杉堿甲含量的報道。超快速液相色譜（ultrafastliquidchromatography，UFLC）是一種新型液相色譜技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于快速分析生物制品和中藥材中目標(biāo)化合物的分離［3］。我們用島津超快速液相色譜儀，通過選用低濃度的乙酸銨緩沖鹽溶液作為流動相，以建立一種快速定量分析石杉堿甲含量的方法。

1 儀器與試藥

ProminenceUFLCXR超快速液相色譜儀（日本島津公司）；AcquityuplcbehC18色譜柱（美國Waters公司）；Milli－Q純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；十萬分之一電子天平（美國Ohaus公司）；真空干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；KQ5200DE超聲儀（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。石杉堿甲（長沙中仁生物科技有限公司，批號：2012120301）；甲醇（德國默克公司）；水為超純水；其它試劑為分析純。

蛇足石杉，2012年7月采自福建省連城縣冠豸山，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室楊成梓副教授鑒定為蛇足石杉Huperziaserrata（Thumb.）Trey.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：AcquityuplcbehC18色譜柱（2.1mmx100mm，1.7μm）；流動相：甲醇（A）和5mmol／L乙酸銨溶液（B，用冰醋酸調(diào)pH至6.0）；洗脫程序：0～1min，28%A，1～4.5min，40%A，4.5～10min，28%A；流速：0.15mL／min；檢測波長：309nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取石杉堿甲對照品10m g，置10m L瓶中加入甲醇使之溶解，并稀釋到刻度，搖勻，作為貯備液，置4℃冰箱中保存，備用。用上述溶液逐級稀釋石杉堿甲儲備液，配制成質(zhì)量濃度為1、4、8、12、16、20、24m g／L的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制 取蛇足石杉新鮮植株按根、莖、葉分離并洗凈，洗凈的植物樣品于50℃烘干，用研缽充分研碎過40目篩，置烘箱中烘至恒重。精密稱取0.1g，加入2%的酒石酸5m L，浸泡過夜，超聲提取2h，17000r／min離心10min，取上清液0.22μm微孔濾膜濾過即得。

2.4 線性范圍 將配制的不同濃度的對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，用得到的峰面積并計算平均值。以對照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：

Y＝37850 X－468.8 r＝0.9998

石杉堿甲在1～24m g／L內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 儀器精密度 取石杉堿甲對照品溶液，按2.1項的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣測定6次，計算石杉堿甲峰面積RSD為0.50%，表明儀器的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性考察 精密稱取蛇足石杉莖粉末，按2.1、2.3項，同法操作，分別于制備后0、2、4、8、16、24h進(jìn)樣分析，石杉堿甲峰面積RSD為0.40%，表明供試品溶液中石杉堿甲在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗 精密稱取蛇足石杉莖粉末6份，按2.1、2.3項，同法操作，結(jié)果石杉堿甲峰面積RSD為2.36%，表明重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收率實驗 石杉堿甲對照品溶液用2%酒石酸稀釋至20m g／L，精密稱取已知含量的蛇足石杉莖粉末0.1g，共6份，加入對照品溶液，按2.1、2.3項，同法操作，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.6 樣品測定 按2.3項的方法配制蛇足石杉不同部位供試品溶液，分別按2.1項的方法重復(fù)分析3次，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛇足石杉不同部位中石杉堿甲的含量，蛇足石杉葉莖根不同部位的含量為0.1099%、0.1107%、0.0266%，RSD為1.04%、0.85%、1.57%。圖1顯示實際樣品中的石杉堿甲與石杉堿甲對照品的色譜圖可以很好地吻合。

表1 石杉堿甲的加樣回收率（n＝6）

3 討 論

3.1 石杉堿甲為堿性化合物，在反相色譜柱上會產(chǎn)生較為嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。為了改善峰形，提高分離度，我們選擇低濃度的乙酸銨作為流動相，用冰醋酸調(diào)節(jié)流動相的p H值，以石杉堿甲色譜峰的保留時間、峰面積及拖尾因子作為考查指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)低濃度的乙酸銨對蛇足石杉不同部位提取物仍有很好的分離效果，當(dāng)用冰醋酸調(diào)節(jié)的乙酸銨p H值在6.0時，石杉堿甲可以得到較好的峰形且拖尾因子值基本穩(wěn)定，從而建立最佳色譜條件。

3.2 測定結(jié)果表明蛇足石杉不同部位的石杉堿甲含量呈莖＞葉＞根的分布規(guī)律，這與杜次［4］等的研究結(jié)果不同，推測石杉堿甲在蛇足石杉的葉中合成后通過莖向地下部根中運(yùn)輸［5］。由于植物的生物堿、萜類等次生代謝產(chǎn)物能夠抵御外界紫外線、蒸發(fā)、寒冷等不利理化條件環(huán)境，其在植株各部位間的分配遵循最佳防御規(guī)律，因此在同一植物的不同部位的濃度也有差異［6］。

［1］王許杰，章海燕 .石杉堿甲改善認(rèn)知功能的臨床研究進(jìn)展［J］.中國新藥與臨床雜志，2012，31（12）：707－712.

［2］張敬彩，魏杰，鐘虹敏，等 .高效液相色譜法定量測定中藥千層塔提取物中的石杉堿甲［J］.色譜，2013，31（1）：79－82.

［3］李芙蓉，陳世忠，羅世恒，等 .UFLC法測定茜草中羥基茜草素和大葉茜草素［J］.中草藥，2010，41（12）：2087－2089.

［4］杜次，李菁，田向榮，等 .湘西蛇足石杉不同部位石杉堿甲分布及與L D C 表達(dá)的關(guān)系［J］.中藥材，2013，36（3）：361－364.

［5］杜次，彭清忠，田向榮，等 .湘西蛇足石杉中石杉堿甲乙和丙含量的測定［J］.廣西植物，2013，33（3）：406－409.

［6］閆鳳鳴 .化學(xué)生態(tài)學(xué)［M］.2版 .北京：科學(xué)出版社，2011：74－86.

［7］周小雷，袁經(jīng)權(quán)，王碩，等 .H P L C法測定不同季節(jié)千層塔中石杉堿甲和石杉堿乙含量［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2013，28，（2）：504－506.