白花鬼針草乙酸乙酯部位對R KO細胞線粒體膜電位的影響

吳建國，吳巖斌，萬仲賢，鄒秀紅，吳錦忠

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.永春縣林業局，福建 永春 362600）

白花鬼針草（Bidenspilosavar.radiata Schult.Bip.）為菊科植物白花鬼針草的全草，為泛熱帶性植物，是民間草藥，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀活血的功效，主要用于治療癰腫瘡癤、感冒發熱、濕熱黃疸、風濕痹痛等［1］。我們前期研究表明白花鬼針草乙酸乙酯部位（E E－B P）含有多個黃酮類化合物［2］，能顯著誘導結腸癌R KO細胞的凋亡［3］。線粒體膜電位（△Ψm）的破壞是細胞凋亡早期發生的一個標志性事件，細胞受到凋亡誘導后線粒體膜電位的變化使得膜的通透性發生改變。膜通透性的增加，使得線粒體蛋白包括細胞色素C等，從線粒體基質釋放到細胞漿。細胞色素C的釋放伴隨膜電位的完全喪失，進而引發細胞凋亡酶的級聯效應［4］。我們應用流式細胞術，以J C－1（5，5＇，6，6＇－四氯－1，1＇，3，3＇－四乙基苯并咪唑羰花青碘化物）為熒光探針檢測E E－B P對結腸癌R KO細胞線粒體膜電位的影響。

1 材 料

1.1 藥物和細胞株 白花鬼針草購自福建省泉州市永春縣藥材市場，經福建中醫藥大學藥學院楊成梓副教授鑒定為菊科植物鬼針草屬白花鬼針草Bidenspilosavar.radiata Schult.Bip.的全草，人結腸癌R KO細胞購自中國科學院上海生命學院細胞資源中心。

1.2 試劑 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；DMEM培養液、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Hyclone公司）；青霉素－鏈霉素雙抗試劑（北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）。

1.3 儀器YXQ－LS－70A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；SW－CJ－1FDA超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；BCD－518WSA冰箱（中國海爾集團有限公司）；Eppendorf移液器、5417R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；AnkeTDL－50B離心機（上海安亭科學儀器廠）；HF212UVCO2培養箱（香港HealForce公司）；D K－420型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司）；流式細胞儀（美國B D公司）。

2 方 法

2.1 乙酸乙酯部位制備 將干燥的白花鬼針草全草10k g置于多功能提取濃縮機組提取罐中，加75%的乙醇，浸泡12h，加壓回流提取2次；合并提取液，過濾并減壓濃縮，得到白花鬼針草的乙醇總提取物。總提取物以水混懸后，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，乙酸乙酯萃取液經過減壓濃縮、干燥后，得乙酸乙酯部位（EE－BP）。

2.2 含藥培養液的制備取EE－BP以DMSO溶解后，配置成0、25、50、100μg／m L的含藥培養液（含10%FBS、1%雙抗的DMEM 溶液），以0.22μm微孔濾膜過濾除菌后密封，保存于4℃，備用。

2.3 R KO細胞線粒體膜電位檢測 R KO細胞置于含10%F B S的低糖DMEM培養液的6孔板中，37℃、5%C O2飽和濕度的細胞培養箱中貼壁培養24h后，棄培養液；0、25、50、100μg／m L的含藥培養液，干預12h后，胰蛋白酶消化后重懸；離心收集5×105細胞，PBS洗滌2遍；加入500μL的JC－1工作液吹打，將細胞混懸，并在培養箱中繼續孵育20min，離心，棄上清；加入500μL的Incubation Buffer溶液重新混懸細胞，于流式細胞儀進行檢測分析。

3 結 果

實驗結果見表1、圖1～圖4。

表1 E E－B P對R KO細胞線粒體膜電位的影響（±s）

表1 E E－B P對R KO細胞線粒體膜電位的影響（±s）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.01。

2550100線粒體膜電位 34.27±0.7410.26±1.551） 22.96±2.871） 29.92±3.451）組 別 n 空白對照組 E E－B P組／（μg／m L）

4 討 論

在空白對照組中，△Ψm較高，部分以聚合體的形式存在，紅色熒光強。隨著E E－B P給藥濃度的不斷增加，紅色熒光不斷減弱，△Ψm去極化，J C－1部分以單體的形式存在，發出綠色熒光，其丟失率隨著給藥的濃度增加而增加，具有顯著性差異，P＜0.01，說明E E－B P可以通過降低△Ψm，誘導R KO結腸癌細胞的凋亡。

［1］中華本草編委會 .中華本草［M］.上海：上海科學技術出版社，1999：735.

［2］WU J G，WAN Z X，WU Y B，et al.CHEMICAL CONSTITUENTS OF Bidens pilosavar.radiate［J］.Chem Nat Comp，2013，49（4）：759－760.

［3］WU J G，WAN Z X，Y I J，et al.Investigation of the extracts from Bidens pilosa Linn.var.radiata Sch.Bip.for antiox idantactivities and cytotoxicity against human tumor cells［J］.JNa t Med，2013，67（1）：17－26.

［4］姚成才，涂遠榮，姜杰，等 .欖香烯乳誘導線粒體凋亡途徑逆轉肺癌A 549／DDP細胞株耐藥［J］.現代腫瘤醫學.2014，22（6）：1276－1281.