脊髓神經細胞缺血再灌注損傷模型的建立及鑒定

林 翔，王榮茂，聶光瑞，張 俐

（福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004）

脊髓神經細胞缺血再灌注損傷模型的建立及鑒定

林 翔，王榮茂，聶光瑞，張 俐

（福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004）

目的：探索SD胎鼠原代脊髓神經細胞缺血再灌注損傷模型的建立方法。方法：將妊娠15 d的孕鼠處死后取出胎鼠脊髓，分離神經細胞行原代細胞培養，采用谷氨酸誘導脊髓神經損傷的方法制作脊髓缺血再灌注損傷模型，通過測定細胞活力及培養液中LDH、MDA含量確定谷氨酸的最佳濃度及作用時間，鑒定模型。結果：采用200 μmol/mL谷氨酸液作用15 min可方便地制作脊髓神經細胞缺血再灌注損傷模型。結論：通過模擬谷氨酸過度釋放環節，制作脊髓神經細胞缺血再灌注損傷模型，方法簡便，可重復性高。

缺血再灌注；脊髓神經細胞；動物模型

脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord ischemicreperfusion injury，SCII）作為原發性脊髓損傷的繼發性損害，常造成神經細胞損傷、脊髓神經功能喪失，引起截癱，給社會及家庭造成沉重負擔。近年來越來越多的研究表明興奮性氨基酸（excitatory amino acids，EAAs）介導的神經毒作用在SCII中占重要地位。EAAs包括谷氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸，其中谷氨酸在SCII中起關鍵作用。本實驗通過模擬谷氨酸過度釋放環節，制作脊髓神經細胞缺血再灌注損傷模型。現將我們的制作方法與過程介紹如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雌雄SD大鼠，體重為300 g左右，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供（許可證號：SCXK（滬）2003－0003）。

1.1.2 儀器與試劑 CKX－41型相差倒置顯微鏡（Olympus，Japan），體式顯微鏡（Olympus，Japan），數碼相機（Olympus，Japan），二氧化碳恒溫培養箱（Heraeus，BB5060），無菌超凈工作臺（Healforce），恒溫箱（上海躍進器械廠），電子秤（Hangping精度0.000 1 g），體視解剖顯微鏡（Nikon smz645），胰蛋白酶（Amresco），多聚賴氨酸（MW 1.5×105～3.0×105，sigma），阿糖胞苷（sigma，C1768），DMEM/F12培養液（Hyclone），PBS緩沖鹽溶液、丙二醛試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒、谷氨酸（購自福州晶泰生物公司）。

1.2 脊髓神經細胞的原代培養

將成年雌雄SD大鼠合籠飼養，每日檢查雌鼠陰道內有無孕栓，以檢出孕栓為妊娠第1天，妊娠15 d用脫頸椎法處死孕鼠，取出胎鼠，用Hanks液沖洗3次，將胎鼠俯臥于培養皿中，由頸向尾在胎鼠背側輕輕剝離皮膚，分離尚未愈合的脊椎骨，沿脊髓分離兩邊的組織，完全暴露整條脊髓，剝離脊膜，然后從正中溝處用鎢絲針切除雙側脊髓的后外側部，留取腹側部。

取出的脊髓用PBS液清洗2次后將脊髓剪成1 mm3的小塊，放入1～1.5 mL 0.25%胰蛋白酶液中，搖勻，置于含5%CO2的37℃培養箱中30 min，其

間震蕩3～5次。用2～3 mL培養液終止消化，直頭滴管輕輕吹打組織10～15次，形成細胞懸液，用200目篩網過濾。濾液經1 000 r/min離心8 min，去上清，加入少許培養液，吹打分散成細胞濃縮懸液。將數滴細胞懸液滴加到多聚賴氨酸預處理過的放有蓋玻片的直徑60 mm的培養皿中，孵育3～5 h后，再補加培養液。24 h后全量換液，以后2～3 d半量換液，第3天加終濃度為2.5 μg/mL的阿糖胞苷作用48 h抑制非神經細胞增殖。

1.3 脊髓神經細胞缺血再灌注損傷模型的建立及鑒定

將前述培養的脊髓神經細胞在無菌條件下，迅速吸凈原孵育液，加入谷氨酸液（谷氨酸與無血清高糖合成培養液配制）孵育后全部吸出，置換原孵育液培養，即可制成大鼠脊髓神經細胞缺血再灌注損傷模型。模型制作過程中谷氨酸液中谷氨酸的最佳濃度及最佳作用時間采用以下方法確定：將培養的脊髓神經細胞隨機分為5組（每組6孔細胞），將50 μmol/mL、100 μmol/mL、200 μmol/mL、500 μmol/mL、1 000 μmol/mL分別作用于各組神經細胞10 min后，置換原孵育液后繼續培養24 h，MTT法測定細胞活力及培養液中LDH、MDA含量，以確定谷氨酸液的最佳濃度。將培養的脊髓神經細胞隨機分為5組（每組6孔細胞），將最佳濃度的谷氨酸液分別作用于各組神經細胞5 min、10 min、15 min、20 min、40 min后，置換原孵育液后繼續培養24 h后，MTT法測定細胞活力及培養液中LDH、MDA含量，以確定谷氨酸液的最佳作用時間。

2 結果

本實驗在相同的作用時間內，谷氨酸濃度越高，LDH、MDA含量及細胞的死亡率越大，200 μmol/mL谷氨酸液作用脊髓神經細胞10 min時細胞死亡率為40%，接近50%，既造成了細胞缺血再灌注損傷，又利于觀察實驗藥物對脊髓神經細胞的影響。故認為200 μmol/mL為最佳的谷氨酸濃度。隨著200 μmol/mL谷氨酸液作用時間的延長，LDH、MDA及細胞的死亡率增大，200 μmol/mL谷氨酸液作用15 min后細胞死亡率近50%，既造成了細胞缺血再灌注損傷，又利于觀察實驗藥物對脊髓神經細胞的影響。故認為200 μmol/mL谷氨酸液的最佳作用時間為15 min。因此，大鼠脊髓神經細胞體外培養谷氨酸損傷模型建立中谷氨酸液的最佳濃度是200 μmol/mL，最佳的作用時間是15 min。結果見表1、表2。

表1 不同濃度谷氨酸液作用脊髓神經細胞10 min后LDH、MDA含量及細胞死亡率 （±s）

表1 不同濃度谷氨酸液作用脊髓神經細胞10 min后LDH、MDA含量及細胞死亡率 （±s）

項目 谷氨酸液濃度（μmol/mL）50 100 200 500 1 000 LDH（OD） 0.26±0.069 0.35±0.030 0.42±0.023 0.66±0.045 0.75±0.022 MDA［μmol/（g·pr）］7.45±0.202 8.66±0.198 10.70±0.464 20.58±0.667 29.71±1.242細胞死亡率（%） 0.21±0.014 0.30±0.014 0.40±0.026 0.72±0.043 0.85±0.026

表2 脊髓神經細胞在200 μmol/mL谷氨酸液不同作用時間下LDH、MDA含量及細胞死亡率（±s）

表2 脊髓神經細胞在200 μmol/mL谷氨酸液不同作用時間下LDH、MDA含量及細胞死亡率（±s）

項目 谷氨酸液作用時間（min）5 10 15 20 40 LDH（OD） 0.27±0.051 0.43±0.039 0.49±0.024 0.59±0.016 0.67±0.027 MDA［μmol/（g·pr）］8.36±0.812 10.41±0.754 11.28±0.370 12.58±0.361 21.69±0.483細胞死亡率（%） 0.27±0.037 0.41±0.023 0.51±0.022 0.68±0.059 0.80±0.021

3 討 論

根據神經損傷的機理，可模仿其中某個環節引發神經細胞壞死或凋亡，從而進行藥物的篩選。現有脊髓神經細胞缺血再灌注損傷的造模方法主要有以下幾種：①缺氧損傷模型；②缺糖損傷模型；③谷氨酸損傷模型；④NO神經毒性模型；⑤葡萄糖氧化酶損傷模型；⑥過氧化氫損傷模型；⑦咖啡因損傷模型等［1-2］。以上模型各具特點：①、②模型主要模擬缺血缺氧環節，③模型主要模擬缺血再灌注損傷后谷氨酸過度釋放環節，④、⑤、⑥模型主要模擬氧自由基損傷過程，而⑦模型主要模擬神經損傷Ca2+超載環節［3］。故前三種模型為干預脊髓缺血再灌注損傷過程上游因素，而后四種模型為干預脊髓缺血再灌注損傷過程下游因素。干預上游因素對脊髓缺血再灌注損傷過程的模擬較符合實際，誤差較小。又因缺氧、缺糖模型對實驗儀器要求較多，須加入較多化學試劑［4］，故我們選擇采用谷氨酸損傷模型模擬脊髓神經細胞缺血再灌注損傷過程。

本研究結果表明，采用200 μmol/mL谷氨酸液作用脊髓神經細胞15 min制作大鼠脊髓神經細胞缺血再灌注損傷模型方便、快捷又較符合損傷病理過程。

［1］鄧奕，汪寧，朱荃，等.神經細胞損傷的細胞模型研究概況［J］.中華中醫藥學刊，2009，27（2）：374-376.

［2］劉新曼，鄒典定，王大斌，等.海馬神經元興奮性模型的建立及其意義［J］.卒中與神經疾病，2006，13（3）：138-141.

［3］Fujmoto S，Katsuki H，Kume T，et al.Mechanisms of oxygen glucose deprivation-induced glutamate release from cerebrocortical slice cultures［J］. Neurosci Res，2004，50（2）：179-187.

［4］孫蓉，衣銀萍，呂麗莉.麝香酮對連二亞硫酸鈉造成PC12細胞缺氧損傷的保護作用［J］.中藥藥理與臨床，2008，24（1）：15-17.

（編輯：張世霞）

Establishment and qualification of the spinal cord nerve cells ischemia-reperfusion animal model

Lin Xiang，Wang Rongmao，Nie Guangrui，Zhang Li
（People′s Hospital Affiliated to Fujian University of TCM，Fuzhou Fujian 350004）

Objective：To establish animal model of spinal cord nerve cells ischemia－reperfusion in rats.Methods：The rats on 15th day of gestation were killed，spinal cord nerve cells of fetal rat was taken out.Then nerve cells were separated and cultured.The spinal nerve cells ischemia－reperfusion model was established by damaging induced by glutamate.The appropriate concentration and duration of glutamate were determined by cell viability，content of LDH and MDA in culture medium.Results：It was easy to establish the spinal nerve cell ischemia－reperfusion model by exposed to 200 μmol/mL glutamate for 15 min.Conclusion：This method is convenient and repeatable.

ischemia－reperfusion；spinal cord nerve cells；animal model

R965.1

A

1671-0258（2015）05-0016-02

福建省自然科學基金青年課題項目（2011J05071）

林翔，副主任醫師，醫學博士，E－mail：linxiangcmf@163.com