誘導性多能干細胞在神經系統變性疾病中的研究與應用

董健健(綜述)，程 楠,韓詠竹(審校)

(1.安徽中醫藥大學研究生部,合肥 230038；2.安徽中醫藥大學神經病學研究所附屬醫院神經內科，合肥 230061)

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誘導性多能干細胞在神經系統變性疾病中的研究與應用

董健健1,2△(綜述)，程 楠2※,韓詠竹2(審校)

(1.安徽中醫藥大學研究生部,合肥 230038；2.安徽中醫藥大學神經病學研究所附屬醫院神經內科，合肥 230061)

神經系統變性疾病為一類緩慢起病、病程呈進行性發展、預后不良的疾病。近年來，神經變性疾病的發病率逐步上升。但是, 臨床上對于該類疾病還沒有十分有效的治療方法，其發機制也未完全清楚。隨著體細胞重編程技術的進步，疾病特異性誘導性多能干細胞被逐漸應用于神經變性疾病發病機制、藥物篩選及臨床治療方法的研究。然而，體細胞重編程技術尚處于早期級階段，誘導性多能干細胞存在潛在的致癌風險及產生效率較低等問題，未來研究人員將致力于建立安全、高效、符合臨床標準的誘導性多能干細胞。

神經變性疾病；誘導性多能干細胞；體細胞重編程；細胞模型

神經系統變性疾病是以神經元細胞進行性變性、壞死為共同病理特點，主要累及中樞神經系統的一大類慢性進行性神經系統疾病。該類疾病發病率高，多數病因不明且缺乏有效的治療方法，對其病因病機和有效治療方法的研究一直沒有停止[1]。近年來，隨著誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)技術的出現，因其在神經系統變性疾病的研究(尤其是治療學研究)中具有誘人的應用前景而備受關注[2]。iPSC是利用反轉錄病毒、腺病毒等載體，將某些特殊的轉錄因子導入終末分化的成體細胞，重編程誘導成具有潛在分化功能的干細胞。2006年，Takahashi和Yamanaka[3]將成鼠的成纖維細胞重編程成iPSC，它具有與小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell, ESC)十分相似的生理特性。2007年，iPSC技術在人類體細胞中得以應用[4]。2009年，Ebert等[5]建立了人脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)iPSC模型并應用于SMA的發病機制和治療學研究。現對近年來iPSC在神經變性疾病中的研究和應用加以綜述。

1 iPSC在神經變性疾病發病機制中的研究與應用

1.1 帕金森病(Parkinson′s disease, PD) PD又名震顫麻痹，是最常見的神經變性性疾病之一，以中腦黑質致密部、藍斑神經元色素脫失，黑質色素變淡及出現路易小體為特征。Wernig等[6]發現，通過iPSC獲取的神經上皮樣細胞不僅具有神經前體細胞的典型形態，而且表達神經干細胞的表面標志物nestin、Sox2 和Brn2等。將該類神經前體細胞亞克隆移植入鼠胚的側腦室，移植細胞在腦室內可分化為細胞簇，部分具有遷移至周圍腦組織中的能力，分化成不同多巴胺能神經元。將這些多巴胺能神經元移植入成年PD鼠模型后，相關運動功能得到改善。Soldner等[7]建立了PD特異的iPSC系，并將其定向誘導分化為多巴胺能神經元。Nguyen等[8]將富亮氨酸重復激酶2基因突變患者來源的iPSC誘導分化為多巴胺能神經元發現α-突觸核蛋白明顯升高，并且細胞對過氧化氫、MG-132和6-羥多巴胺的敏感性增強。Byers等[9]建立了α-突觸核蛋白三倍體患者的iPSC系，將其定向誘導為多巴胺能神經元后發現該方法能更好地模擬PD的早期病變過程。Liu等[10]證實，PD患者特異性iPSCs衍生的神經干/前體細胞核結構退化與富亮氨酸重復激酶2基因突變相關。Ryan等[11]發現線粒體毒素(包括農藥百草枯、魚藤酮等)可致PD-iPSC誘導的多巴胺能神經元A53Tα-突觸核蛋白轉錄因子肌細胞增強因子2c發生s-亞硝基化，從而抑制肌細胞增強因子2c-過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1α轉錄網絡，導致線粒體功能障礙和細胞凋亡，最終導致A9多巴胺能神經元的喪失。Roessler等[12]建立了PD患者的iPSC系，并將其定向誘導分化為多巴胺能神經元，且該神經元具有PD疾病表型。Sch?ndorf等[13]通過研究葡糖腦苷脂酶1基因突變患者iPSC衍生的多巴胺能神經元，表明葡糖腦苷脂酶活性和蛋白表達降低，而葡糖神經酰胺和α-突觸核蛋白表達水平增高，并存在自噬和溶酶體缺陷。并且蛋白組學檢測發現該神經元內鈣結合蛋白表達增加，并有鈣穩態的調節障礙[13]。這些研究都證明PD疾病表型可通過特異性iPSC 模型體外重現，為深入研究該疾病的發病機制提供了細胞模型。

1.2 SMA SMA是一種常染色體隱性遺傳病，是一類由編碼1 型活運動神經元(survival motor neuron 1，SMN1)基因突變引起脊髓前角運動神經元和腦干運動神經核變性導致肌無力、肌萎縮的疾病。Ebert等[5]研究證實，1型SMA患者來源的iPSC，與正常人來源的iPSC相比，iPSC衍生的神經元細胞內SMN1蛋白的表達降低，且其衍生的運動神經元的數量和體積都有較明顯的降低。Corti等[14]發動神經元經基因修復后沒有再出現如修復之前的疾病特異性表型。而且，將該種基因修復后的運動神經元移植入SMA小鼠模型體內不僅可延長其壽命且可減輕疾病的癥狀。

1.3 脊髓側索硬化病(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) ALS病變常累及大腦、腦干、脊髓、顱神經核、脊髓前角細胞。由于累及范圍廣泛，患者通常表現為軀干、四肢和頭面部肌肉慢性進行性變性，主要分家族性和散發性兩種。家族性ALS主要是由于超氧化物歧化酶基因突變引起肌肉萎縮與癱瘓。Dimos等[15]將ALS患者來源的iPSC 誘導其分化為運動神經元，但未檢測出表型改變。Mitne-Neto等[16]將ALS患者來源的iPSC模型誘導分化為運動神經元，并發現囊泡相關膜蛋白相關的蛋白B表達水平顯著下降，表明ALS的發生可能與囊泡相關膜蛋白相關的蛋白B基因突變有關。Egawa等[17]報道由ALS患者來源的iPSC模型衍生的運動神經元表達異常高水平的突變反式激活反應DNA結合蛋白43(TAR DNA binding protein-43，TDP43)。Burkhardt等[18]則發現散發性ALS患者來源的iPSC模型誘導分化的運動神經元細胞核內有大量TDP-43蛋白聚集，說明可能是因為TDP-43蛋白的大量聚集導致功能性TDP-43蛋白水平的降低，使TDP-43蛋白功能減低，進而造成運動神經元的凋亡，最終導致疾病的發生。Nishimura等[19]發現TDP-43基因突變的ALS患者來源的iPSC模型誘導分化的神經元細胞質中TDP-43蛋白是正常對照組的2倍，而通過RNA干擾技術對ALS患者來源的iPSC 模型的突變TDP-43基因進行干擾發現細胞質中TDP-43蛋白減少了30%，由此可以推斷RNA干擾技術或許可以作為ALS的治療手段應用于臨床。

1.4 阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD) AD是老年人常見的神經系統變性病，臨床特征為隱襲起病，進行性智能衰退，多伴有人格改變。病因迄今未明。病理上，患者呈彌漫性腦萎縮， 并出現老年斑、神經纖維纏結、海馬椎體細胞顆粒空泡變性及神經元缺失。Seshadri等[20]發現，導致AD的主要遺傳因素為載脂蛋白E、早老素(presenilin,PS) 1、PS2、淀粉樣肽前體蛋白基因突變。Yagi等[21]建立了PS1和PS2基因突變的iPSC系，并誘導分化為神經元細胞。該神經元細胞內較正常對照組有較多的β-淀粉樣蛋白42分泌，證實了β-淡粉樣蛋白聚集導致AD發病的機制。Kondo等[22]發現，由淀粉樣肽前體蛋白基因突變AD患者來源的iPSC模型誘導的神經細胞中Aβ肽的聚集導致內質網應激和氧化應激，進而引起神經細胞的喪失。進一步研究發現，二十二碳六烯酸療法可以減輕這種應激反應，這證明二十二碳六烯酸療法對于AD治療的臨床價值。

1.5 亨廷頓舞蹈病 (Huntington′s disease, HD) HD是一種呈常染色體顯性遺傳的大腦變性疾病，主要癥狀為舞蹈樣動作和進行性認知障礙。病因主要是由于IT15基因中出現多個串聯的CAG重復序列，由此產生異常的神經性舞蹈病蛋白，從而造成細胞毒性而發生神經細胞的變性改變。當CAG重復超過40個時即可導致本病的發生，CAG重復序列擴增越多，患者的起病年齡越早。Zhang等[23]發現，HD患者iPSC來源的紋狀體神經元和神經前體細胞具有和HD患者相似的CAG重復序列，易于受到損傷后凋亡。Cheng等[24]研究發現，miR-196a可降低HD患者來源的iPSC誘導的神經元細胞內神經性舞蹈病蛋白的病理性聚集及過度表達，從而證明miR-196a對HD的潛在治療價值。

2 iPSC在神經變性疾病藥物篩選中的應用

疾病特異性iPSC衍生的特定神經元細胞可作為人體細胞模型用于高通量藥物篩選。目前， iPSC在神經系統變性疾病藥物篩選的研究中已逐步被應用。Ebert等[5]研究證實，丙戊酸和妥布霉素顯著增加SMA小鼠模型核基因的表達，相關實驗也證實SMN1 蛋白顯著增加。Kondo等[22]報道，不同AD患者的iPSC模型衍生的神經元細胞對藥物治療有不同的反應，顯示了患者特異的iPSC模型在個體化治療中的的潛在價值。2014年Asai等[25]應用患者AD來源的iPSC模型衍生的神經元細胞進行個體化的藥物篩選。iPSC的產生為高通量藥物篩選帶來了新的機遇。

3 應用誘導多能干細胞存在的問題及面臨的挑戰

目前，已建立了部分神經系統疾病的iPSC系，為人們對疾病機制研究開辟了新的路徑。然而，iPSC應用于臨床也存在諸多問題，面臨巨大的挑戰。大量研究表明，遺傳物質在體細胞重編程的不同階段都可能發生各種不同形式的變異，而這種變異具有潛在的致癌風險[6,26-27]。因c-Myc和Klf4屬于致癌因子，且以病毒為載體，這使致癌因子被整合到受體基因組內引起基因突變產生致癌性的iPSC的可能性大大增加。同時，iPSC產生的效率比較低，且實驗耗時長，來源于多能干細胞的組織在移植后的存活率很低。這些問題是iPSC在臨床上廣泛應用的諸多障礙，因此， 建立安全、高效、符合臨床標準的iPSC是將其應用于臨床的必要條件，也是目前所要解決的關鍵問題。

4 小 結

因ESC研究涉及諸多法律、倫理、宗教等問題而受到很大制約，而iPSC則避免了這些缺點。目前，疾病患者特異的iPSC建立的模型為研究疾病的發病機制和探究新的、個體化的治療方案提供了新的思路，但若進一步進行細胞治療還有很多問題有待解決，如需建立安全、高效、無創的iPSC獲取方法；需完善iPSC定向誘導分化的方法；需有效、統一的體細胞重編程和誘導分化的評估系統；需探索疾病特異性iPSC誘導分化的神經細胞移植后在體內維持穩定生長和增殖的方法；建立個性化的iPSC庫等。總之，iPSC不僅可為神經系統變性疾病研究和藥物篩選提供細胞模型， 還可為疾病診療方案的研究提供新的診療思路， 因此無論在理論研究方面還是臨床實踐中都具有無可取代的價值。由此可知隨著不同疾病iPSC 系的不斷建立，各種神經變性疾病的發病機制將逐步被發現，神經系統疾病將進入個體化治療的新時代。

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The Research and Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Neurodegenerative Disease

DONGJian-jian1,2,CHENGNan2,HANYong-zhu2.

(1.GraduateSchool,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei230038,China； 2.DpetartmentofNeurology,NeurologicalResearchInstituteAffiliatedHospital,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei230061,China)

Neurodegenerative disease is characterized by slow onset,progressive development and poor prognosis.In recent years,the morbidity of neurodegenerative disease is rising constantly.But there is still no effective clinical therapy, and their pathogenesis remains unclear.Along with the progress of the technology of somatic cell reprogramming,patient-specific induced pluripotent stem cells(iPSC) have been gradually applied as in vitro models for the study of the pathogenesis of neurodegenerative diseases,drug screening and clinical treatment.However,the technology of somatic cell reprogramming is still in its early stages,and there are still problems such as potential carcinogenic risk and low productivity etc.,therefore the researchers should be devoted to establishing safe,efficient and clinically qualified iPSC.

Neurodegenerative diseases; Induced pluripotent stem cell; Somatic cell reprogramming; Cell model

國家自然科學基金(81072738；81173212)

R741

A

1006-2084(2015)12-2120-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.004

2014-09-09

2014-12-01 編輯：相丹峰