H7N9禽流感病毒基因檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

張 賽(綜述)，陸 軍(審校)

(1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 淮南 232001； 2.滁州市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，安徽 滁州 239000)

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檢測(cè)醫(yī)學(xué)

H7N9禽流感病毒基因檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

張 賽1,2△(綜述)，陸 軍1※(審校)

(1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 淮南 232001； 2.滁州市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，安徽 滁州 239000)

2013年3月在上海和安徽兩省市率先發(fā)現(xiàn)人感染H7N9禽流感病例，現(xiàn)已累計(jì)報(bào)告數(shù)百例病例。H7N9禽流感病毒因其對(duì)人類的高致病性和迅速的傳播速度引起全球的廣泛關(guān)注。快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)H7N9禽流感的疫情監(jiān)測(cè)和控制極為重要。該文就目前應(yīng)用于H7N9禽流感病毒研究中的基因檢測(cè)技術(shù)(包括聚合酶鏈反應(yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、基因芯片、液相芯片、依賴核酸序列擴(kuò)增法、高通量測(cè)序等)的研究進(jìn)展予以綜述。

禽流感病毒;H7N9；基因檢測(cè)技術(shù)

2013年3月底，上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)人感染H7N9禽流感病例，引發(fā)此次疫情的是一種新型重配病毒[1-3]。人感染H7N9禽流感病毒臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽和少痰等流感樣癥狀[4]。目前，尚不能排除人傳人的可能[5]。H7N9禽流感病毒檢測(cè)是人感染H7N9禽流感防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其病原學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室要求高，條件苛刻，不易普遍實(shí)施。基因檢測(cè)技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)潔、快速等優(yōu)點(diǎn)，克服了病原學(xué)檢測(cè)的局限性，為H7N9禽流感病毒檢測(cè)提供了新途徑。因此，基因檢測(cè)技術(shù)在H7N9禽流感病毒防治中將會(huì)有更重要的應(yīng)用前景。現(xiàn)主要對(duì)國(guó)內(nèi)外檢測(cè)H7N9禽流感病毒的基因檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述。

1 聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是利用體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，在短時(shí)間內(nèi)獲得大量目的基因。PCR是近年來(lái)學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于H7N9禽流感病毒檢測(cè)，具有快捷、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)。

1.1 實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄-PCR(reverse transcriptase PCR,RT-PCR) 近年來(lái)，以基因檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)的禽流感病毒檢測(cè)方法飛速發(fā)展，實(shí)時(shí)RT-PCR是RNA病毒基因檢測(cè)中使用最普遍的分子擴(kuò)增法，通過(guò)擴(kuò)增標(biāo)本中病毒基因組RNA片段，可鑒定流感病毒并進(jìn)一步亞型分析[6]，被認(rèn)為是H7N9禽流感檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[5,7]。Gao等[1]利用RT-PCR在3例患者的咽拭子中提取到H7N9禽流感病毒核酸。該方法使用廣泛，但反轉(zhuǎn)錄的DNA分子易污染實(shí)驗(yàn)儀器和環(huán)境，試驗(yàn)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)在1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出[8]，是在RT-PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)循環(huán)閾值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。Wong等[9]設(shè)計(jì)的“一步法”實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 對(duì)H7N9禽流感病毒檢測(cè)，靈敏度達(dá)到0.04 TCID50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染性量)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需要3 h。Zhu等[10]針對(duì)1例安徽株和2例上海株H7N9禽流感病毒的HA、NA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和賽博綠熒光標(biāo)記探針，通過(guò)測(cè)試106拷貝/μL～10拷貝/μL系列10倍稀釋的體外轉(zhuǎn)錄病毒，以循環(huán)閾值對(duì)應(yīng)的RNA拷貝數(shù)構(gòu)造標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立以賽博綠為探針的RT-PCR檢測(cè)方法；結(jié)果顯示，該試驗(yàn)建立的H7、N9標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與對(duì)應(yīng)的RNA拷貝數(shù)具有很好的線性關(guān)系，H7相關(guān)系數(shù)為0.991，N9相關(guān)系數(shù)為0.997，最低檢測(cè)限為10拷貝，與Taqman探針靈敏度類似。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速并且可以對(duì)樣品進(jìn)行定量分析的優(yōu)點(diǎn)，已大規(guī)模使用于流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 多重RT-PCR 多重RT-PCR法是在同一PCR反應(yīng)體系中加入2個(gè)以上病毒亞型或多種病毒的特異性引物，利用目的片段的長(zhǎng)度不同，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)病毒亞型或多種病毒在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)，是一種快速、敏感且經(jīng)濟(jì)有效的檢測(cè)方法。羅思思等[11]針對(duì)H7N9禽流感病毒的HA、NA基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針建立雙重RT-PCR；結(jié)果顯示，該方法具有快速、特異和敏感的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)下限為102 拷貝/L；實(shí)現(xiàn)了對(duì)H7N9禽流感病毒檢測(cè)的“一步法”，引物的特異性和探針的特異性保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)比普通PCR檢測(cè)技術(shù)靈敏度高100倍以上。莫秋華等[12]針對(duì)H7N9禽流感病毒的HA和NA基因設(shè)計(jì)特異性引物，選擇人源基因beta-actin設(shè)計(jì)質(zhì)控引物，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件建立“一步法”四重RT-PCR 反應(yīng)體系，對(duì)混合樣進(jìn)行提取，沒(méi)有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，反應(yīng)體系特異性強(qiáng)，對(duì)不同亞型病毒的檢測(cè)無(wú)交叉反應(yīng)，引物之間無(wú)相互干擾，對(duì)30份核酸樣品經(jīng)盲法試驗(yàn)評(píng)價(jià)與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致，符合率為100%。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是Notomi等[13]在2000年建立的一種新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，通過(guò)對(duì)靶基因的6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)外引物和2對(duì)內(nèi)引物，在恒溫(60～65 ℃)條件下，通過(guò)鏈置換嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillus stearothermophilus，Bst)DNA聚合酶的作用反應(yīng)l h，實(shí)現(xiàn)目的靶序列從很低拷貝數(shù)擴(kuò)增到109拷貝數(shù)。董志珍等[14]利用LAMP檢測(cè)H7N9禽流感病毒(安徽株)，其靈敏度達(dá)到10拷貝，靈敏度與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR一致，該方法具有操作簡(jiǎn)單、快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)果根據(jù)擴(kuò)增副產(chǎn)物形成的沉淀肉眼直接判斷。因其不依賴專門的儀器設(shè)備可在基層或小型實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、臨床快速診斷，是一種新型的H7N9禽流感病毒快速檢測(cè)的技術(shù)與方法。Ge等[15]利用RT-LAMP對(duì)80份H7N9禽流感臨床樣本的HA基因和NA基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，其靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均為100%。Zhang等[16]利用RT-LAMP對(duì)135例臨床樣本檢測(cè)，試驗(yàn)可在12～23 min完成；H7亞型基因的檢出限度為10拷貝,而其對(duì)應(yīng)的N9基因檢測(cè)限度為5拷貝,靈敏度是實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的100倍。

3 基因芯片

基因芯片的基本原理是將RT-PCR獲得的病毒基因的互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)或合成的特異性寡核苷酸探針固化于芯片上，然后用不同熒光標(biāo)記序列或樣品(DNA或cDNA)與芯片上Cy3、Cy5標(biāo)記的核酸探針標(biāo)記的靶核苷酸序列進(jìn)行雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)進(jìn)而獲取細(xì)胞或組織的大量基因信息[17]。王慧煜等[18]對(duì)29份H7亞型陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行正向雜交基因芯片檢測(cè),結(jié)果與病毒分離的結(jié)果符合率達(dá)100%。王秀榮等[19]依據(jù)M蛋白進(jìn)行基因型鑒定和HA基因亞型鑒定，用Cy5熒光標(biāo)記在基因芯片平臺(tái)上構(gòu)建檢測(cè)H7亞型禽流感病毒的實(shí)驗(yàn)技術(shù)模型，檢測(cè)H7亞型的cDNA,雜交達(dá)到預(yù)期結(jié)果。基因芯片技術(shù)具有特異性好、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但因其檢測(cè)成本高、硬件要求高等缺點(diǎn)，在流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用還遠(yuǎn)低于其他檢測(cè)方法。

4 液相芯片

液相芯片，也稱為懸浮陣列、流式熒光技術(shù)，是基于美國(guó)Luminex公司研制的多功能流式點(diǎn)陣儀開(kāi)發(fā)的多功能生物芯片平臺(tái)[20]。它是通過(guò)紅、綠兩束激光分別檢測(cè)可進(jìn)行100種不同生物學(xué)反應(yīng)的微球探針上的編碼和報(bào)告熒光來(lái)實(shí)現(xiàn)定性和定量的目的，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，是將數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、激光技術(shù)及傳化學(xué)技術(shù)融為一體的新型生物分子檢測(cè)技術(shù)。張曉娜等[21]針對(duì)H7亞型禽流感保守基因，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，將多重不對(duì)稱RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與偶聯(lián)熒光微球的探針進(jìn)行雜交,建立多重液相芯片檢測(cè)方法，對(duì)50份已知病毒的樣品進(jìn)行液相芯片方法和禽流感檢測(cè)試劑盒雙盲試驗(yàn)，兩者符合率為100%，H7亞型禽流感核酸的最低檢出量為28.7 pg/μL，檢測(cè)的特異性良好，且禽流感常見(jiàn)病毒與其他亞型無(wú)交叉反應(yīng)，重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)在10%以內(nèi)。

5 依賴核酸序列的擴(kuò)增法

依賴核酸序列的擴(kuò)增法(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是一項(xiàng)以RNA為模板無(wú)需反轉(zhuǎn)錄的快速等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，賴于鳥(niǎo)類成髓細(xì)胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶、噬菌體T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、兩種特別設(shè)計(jì)的特異性寡核苷酸引物和分子信標(biāo)探針共同協(xié)作而完成。Collins等[22]基于M基因和H7亞型的HA基因已成功開(kāi)發(fā)出可檢測(cè)禽流感群特異性H7亞型(NASBA-H7)的NASBA/ECL(電化學(xué)發(fā)光)檢測(cè)試劑盒，檢出時(shí)間只需6 h，比商品化的免疫檢測(cè)試劑盒敏感至少高1000倍，比常規(guī)PCR方法也敏感許多，與現(xiàn)行病毒培養(yǎng)的檢測(cè)方法靈敏度相當(dāng),可準(zhǔn)確無(wú)誤地檢測(cè)出病毒。該方法的優(yōu)點(diǎn)是RNA分子不易對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和環(huán)境造成污染，避免了試驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性，缺點(diǎn)是檢測(cè)成本過(guò)高。

6 高通量測(cè)序

高通量測(cè)序又名下一代測(cè)序，是將目標(biāo)DNA剪切為小片段結(jié)合到固相表面進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增，每次只復(fù)制1個(gè)堿基(A、C、T、G)，通過(guò)高分辨率的成像系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)。趙康辰等[23]以U12引物反轉(zhuǎn)錄cDNA,通用流感病毒全基因擴(kuò)增引物混合物生成雙鏈cDNA制備高通量測(cè)序模板對(duì)8份樣品進(jìn)行檢測(cè)，從模板制備、文庫(kù)構(gòu)建到序列及數(shù)據(jù)分析等在2 d內(nèi)完成；該方法不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，病毒RNA可直接制備測(cè)序模板，測(cè)序模板用量只需要1 ng的雙鏈cDNA，具有準(zhǔn)確性高、周期短、可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)且成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，使大規(guī)模H7N9禽流感病毒基因組檢測(cè)變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

7 小 結(jié)

H7N9禽流感疫情爆發(fā)讓公眾的眼光再次聚焦于流感實(shí)驗(yàn)室診斷。基因檢測(cè)技術(shù)為H7N9禽流感提供了高靈敏度、強(qiáng)特異性且快速的診斷，為疫情的控制提供了寶貴的時(shí)間和準(zhǔn)確的流行病學(xué)信息，避免了疫情的大規(guī)模蔓延。但基因檢測(cè)技術(shù)并不能解決所有問(wèn)題，有一定的局限性。因此，在H7N9禽流感病毒的檢測(cè)過(guò)程中，要不斷探索不同檢測(cè)技術(shù)及不同學(xué)科之間的融合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，推進(jìn)H7N9禽流感病毒基因檢測(cè)技術(shù)進(jìn)入新的發(fā)展階段。

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Advance in Gene Techniques for Detection of Avian Influenza A (H7N9) Virus

ZHANGSai1,2,LUJUN1.

(1.DepartmentofAetiology&Immunology,MedicalCollege,AnhuiUniversityofScience&Technology，Huainan232001,China; 2.DepartmentofCentralLaboratory,ChuzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Chuzhou239000,China)

In March 2013,cases of avian influenza A(H7N9) infection have been firstly found in Shanghai and Anhui,and there has been hundreds of cases reported so far.The influenza A(H7N9) is a pathogen with highly pathogenicity to human and able to spread rapidly,which has attracted global attention.It is very important to establish a rapid and sensitive method for avian influenza A(H7N9) detection and control.Here is to make a review of the gene techniques used in detection of avian influenza A,including polymerase chain reaction,loop-mediated isothermal amplification,gene chip,liquid chip,nucleic acid sequence-based amplification and high-throughput sequencing.

Bird flu virus; H7N9; Gene detection techniques

R373.13；R511.7

A

1006-2084(2015)12-2226-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.042

2014-10-10

2014-12-18 編輯：鄭雪