哺乳動物胚胎體外培養(yǎng)的研究進展

丁 芳(綜述)，周紅林(審校)

(1.三峽大學仁和醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 宜昌 443001； 2.昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院婦科，昆明 650101)

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哺乳動物胚胎體外培養(yǎng)的研究進展

丁 芳1※(綜述)，周紅林2(審校)

(1.三峽大學仁和醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 宜昌 443001； 2.昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院婦科，昆明 650101)

葡萄糖對卵裂階段胚胎的發(fā)育有抑制作用，但早期胚胎體外發(fā)育中添加葡萄糖并不是完全不必要的，8-細胞前需要非必需氨基酸，8-細胞及以后利用所有氨基酸。低濃度必需氨基酸促進胚胎發(fā)育，高濃度必需氨基酸抑制胚胎發(fā)育。牛血清白蛋白等大分子物質(zhì)既能供給胚胎營養(yǎng)，促進細胞生長、增殖與分裂，又能消除血清的不利影響，是很好的蛋白質(zhì)替代品，一些生長因子對胚胎發(fā)育起積極作用。共培養(yǎng)及序貫培養(yǎng)雖可以改善胚胎發(fā)育狀況，但也存在一些負面影響。

哺乳動物；胚胎；體外培養(yǎng)

哺乳動物早期胚胎的體外培養(yǎng)已經(jīng)歷了半個多世紀的發(fā)展，大量的實驗室研究主要集中在培養(yǎng)液優(yōu)化上，對于培養(yǎng)液的優(yōu)化主要體現(xiàn)在兩個方面：一種是改進化學成分明確的培養(yǎng)液，如在化學成分明確的培養(yǎng)液中適當減除、替代或添加某些組分來改進培養(yǎng)液，因此需要掌握簡單培養(yǎng)液中的基本成分有哪些及各自的作用是什么，這樣才有利于對處理因素的觀察分析，有利于探討早期胚胎的發(fā)育機制；另一種采用體細胞與胚胎共同培養(yǎng)，或?qū)⑴咛ピ诓煌l(fā)育階段放入不同培養(yǎng)液中進行序貫培養(yǎng)等，其目的在于提高哺乳胚胎的體外發(fā)育率、種植率及妊娠率。該文旨在研究哺乳動物胚胎最佳體外培養(yǎng)條件，以期體外培養(yǎng)胚胎更接近體內(nèi)自然狀態(tài)，從而進一步推動生命科學相關(guān)學科的發(fā)展。

1 培養(yǎng)液及其發(fā)展

自1956年Whitten[1]成功實現(xiàn)小鼠胚胎體外的培養(yǎng)以來，培養(yǎng)基經(jīng)歷了無數(shù)次的更新與發(fā)展，如早期的簡單培養(yǎng)液、Brinster′s培養(yǎng)液、修正的Whitten′s培養(yǎng)液、M16、MTF和HTF培養(yǎng)液等，這些培養(yǎng)液雖然在一些品系的小鼠上取得成功，但遇到一個共同的難題，即“2-細胞阻滯”現(xiàn)象。Chatot等[2-3]發(fā)明了CZB培養(yǎng)液，同時用該培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠胚胎，使部分品系的小鼠突破了2-細胞阻滯現(xiàn)象，發(fā)育到囊胚。隨后，Lawitts和Biggers[4]設(shè)計了KSOM培養(yǎng)液，增加更多品系小鼠胚胎的囊胚發(fā)育率。復合培養(yǎng)液同樣經(jīng)歷了無數(shù)次的改進，最早的復合培養(yǎng)液有20世紀50年代設(shè)計的Ham′sF10、TCM199，隨后80年Keefer等[5]發(fā)現(xiàn)了BME和Ham′sF10(1∶1)的混合培養(yǎng)液，證實該培養(yǎng)液更利于兔胚胎的體外發(fā)育。后來，Jin等[6]發(fā)現(xiàn)了RDH(RPMI1640/DMEM/Ham′s F10 1∶1∶1)和RD(RPMI1640/DMEM 1∶1)的混合培養(yǎng)液，同時體外培養(yǎng)囊胚成功并獲得仔兔。每一次發(fā)現(xiàn)都在不同程度上改善了哺乳動物胚胎的體外發(fā)育率，都是生命科學史上里程碑的一次突破。

2 培養(yǎng)液主要成分

2.1 能量底物 哺乳動物輸卵管液和子宮液中的主要能量底物有丙酮酸、乳酸及葡萄糖，不同物種的生殖道中，這3種能量底物的濃度各不相同。研究證實，哺乳動物早期胚胎卵裂階段的主要供能物質(zhì)是丙酮酸和乳酸，葡萄糖對卵裂階段胚胎的發(fā)育有抑制作用，致密化期以后主要利用葡萄糖供能。然而，近年來研究表明，葡萄糖對綿羊、豬的植入前胚胎的體外發(fā)育無抑制作用[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，一種含有恒定濃度4.7 mmol/L 葡萄糖的復雜培養(yǎng)液，能完全支持人類受精卵發(fā)育到囊胚階段[8]。生理狀態(tài)下哺乳動物輸卵管和子宮液中能檢測到葡葡糖的存在，由此可以推測，早期胚胎體外培養(yǎng)液中葡萄糖的添加并不是完全不必要的，葡萄糖在早期胚胎體外發(fā)育中具體的作用時間及作用機制目前尚不完全清楚。

2.2 氨基酸 自1990年國外研究者首次發(fā)現(xiàn)了氨基酸在小鼠胚胎體外培養(yǎng)中的作用以來，人們對氨基酸進行了反復的研究，Eagle將氨基酸分為必需氨基酸和非必需氨基酸，在2-細胞階段添加非必需氨基酸和谷氨酸能提高小鼠囊胚形成率、細胞數(shù)、孵化率和移植后發(fā)育潛力[9-10]。非必需氨基酸還能促進8～16細胞到囊胚階段哺乳動物胚胎發(fā)育[11]，8-細胞前添加必需氨基酸抑制囊胚的發(fā)育[4]，8-細胞階段添加必需氨基酸卻能促進內(nèi)細胞團的發(fā)育和隨后胎兒的發(fā)育[12]，低濃度的必需氨基酸對水牛體外受精-胚胎移植的胚胎的發(fā)育具有一定促進作用,但高濃度則有抑制作用[13]。必需氨基酸的濃度降到半濃度時，能提高小鼠植入前胚胎的體外發(fā)育[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的必需氨基酸代謝和自由降解中會產(chǎn)生對胚胎有毒性的銨。當以1 mmol/L的谷氨酰胺衍生物丙氨酰基-谷氨酰胺替代谷氨酰胺時，可以顯著降低銨的生成[14]。同時添加必需和非必需氨基酸到MSOM培養(yǎng)液中，濃度為Eagle′s培養(yǎng)液一半時，能支持小鼠受精卵發(fā)育到囊胚后期，而且能促進內(nèi)細胞團的增殖[15]。

2.3 蛋白質(zhì)和大分子物質(zhì) 有研究發(fā)現(xiàn)，血清能提高早期胚胎體外發(fā)育的囊胚率[16]，培養(yǎng)系統(tǒng)中血清成分的缺乏會影響胚胎表面微絨毛的發(fā)育。胎牛血清可以促進豬孤雌胚胎的早期體外發(fā)育[17]。添加混合血清能促進水牛胚胎體外發(fā)育[18]。牛血清白蛋白對山羊體外受精卵具有明顯促卵裂作用[19]。胰島素樣生長因子2、胰島素能增加體外培養(yǎng)的囊胚細胞數(shù)[20]，表皮生長因子及胰島素樣生長因子2對體外培養(yǎng)鼠胚的發(fā)育有協(xié)同促進作用[21]。0.1 μg/L胰島素樣生長因子2和表皮生長因子作為胚胎培養(yǎng)濃度較佳[22]。白細胞抑制因子促進2～8細胞胚胎發(fā)育至桑椹胚，同時也能促進桑椹胚向擴大囊胚和孵化囊胚發(fā)育，白細胞介素1β、白細胞介素2、白細胞介素6及干擾素γ對綿羊早期胚胎的發(fā)育無顯著影響[23]。

3 培養(yǎng)體系的改進

3.1 共培養(yǎng) 國外有研究證實不合適的培養(yǎng)體系可以導致胚胎發(fā)育異常，20世紀80年代末期，研究者們研究出一種新型的培養(yǎng)技術(shù)——細胞共培養(yǎng)技術(shù)，細胞共培養(yǎng)是將2種或2種以上的細胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，共培養(yǎng)能使細胞間相互溝通信息，相互支撐生長增殖，能更真實地模擬體內(nèi)環(huán)境。國內(nèi)研究者認為共培養(yǎng)體系主要有以下優(yōu)點：誘導細胞向另一種細胞分化、誘導細胞自身的分化、維持細胞的功能和活力、對細胞增殖進行調(diào)控、促進早期胚胎的發(fā)育和提高代謝物的產(chǎn)量。有學者采用人卵丘細胞、昆明鼠卵丘細胞、昆明鼠成纖維細胞分別與昆明鼠2細胞期胚胎共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同類型的體細胞共培養(yǎng)體系均可在體外為胚胎發(fā)育提供一種更類似于體內(nèi)的環(huán)境，有利于胚胎在體外發(fā)育[24]。含有小鼠輸卵管上皮細胞+垂體細胞的CZB培養(yǎng)液可有效促進小鼠孤雌胚胎突破2細胞阻滯[25]。在體外環(huán)境下,牛體外胚胎與子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)后能正常孵化[26]。共培養(yǎng)能顯著提高2-細胞發(fā)育率、降低胚胎內(nèi)部H2O2水平，提高4-細胞率及降低胚胎內(nèi)部H2O2水平[27]。

3.2 序貫培養(yǎng)與序貫共培養(yǎng) 與胚胎培養(yǎng)全程在同一培養(yǎng)液中進行遠不能滿足胚胎對營養(yǎng)物質(zhì)的需求，鑒于這一理論，人們提出了序貫培養(yǎng)，常用的序貫培養(yǎng)液有用于人胚胎培養(yǎng)G1/G2。劉軍等[28]研究證實，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)液相比，序貫培養(yǎng)液G1/G2能更好地支持山羊核移植胚胎的發(fā)育。G1/G2支持綿羊、牛和豬的體外受精胚胎發(fā)育的報道也屢見不鮮。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，SOF培養(yǎng)液和顆粒細胞+添加胎牛血清的NCSU-23 輸卵管上皮細胞的序貫培養(yǎng)系統(tǒng)能較好地促進胚胎的發(fā)育。后來，有學者又將序貫培養(yǎng)和共培養(yǎng)聯(lián)合起來對胚胎進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)序貫聯(lián)合子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)的方法與單純的體外序貫培養(yǎng)相比，其囊胚形成率更高，是進行廢胚繼續(xù)體外培養(yǎng)的更有效方法[29]。冷凍胚胎經(jīng)序貫共培養(yǎng)能改善胚胎發(fā)育潛能，子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)聯(lián)合序貫成組培養(yǎng)對人早期冷凍時限較長的胚胎發(fā)育具有積極的支持作用[30-31]。

4 小 結(jié)

哺乳動物著床前胚胎培養(yǎng)是一個不斷發(fā)展的領(lǐng)域，目前的培養(yǎng)基及培養(yǎng)體系尚需進一步完善，以期體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境最接近，但由于脫離母體環(huán)境，胚胎的發(fā)育率及質(zhì)量仍有很多問題。如體外發(fā)育過程中暫時結(jié)構(gòu)正常，隨后可能出現(xiàn)基因分化、染色體變異等，這可能是細胞凋亡、胚胎流產(chǎn)、死亡的重要原因，因此，培養(yǎng)基及培養(yǎng)體系的改進是一個值得長期深入研究的課題。

[1] Whitten WK.Culture of tubal mouse ova[J].Nature,1956,177(4498):96.

[2] Chatot CL,Ziomek CA,Bavister BD,etal.An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro[J].J Reprod Fertil, 1989,86(2):679-688.

[3] Chatot CL,Lewis JL,Torres I,etal.Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium[J].Biol Reprod,1990,42(3):432-440.

[4] Lawitts JA,Biggers JD.Culture of preimplantation embryos[J].Methods Enzymol,1993,225:153-164.

[5] Keefer CL,Fayrer-Hosken RA,Brown LM,etal.Culture of in vitro fertilized rabbit ova[J].Gamete Res, 1988,20(4):431-436.

[6] Jin DI,Kim DK,Im KS,etal.Successful pregnancy after transfer of rabbit blastocysts grown in vitro from single-cell zygotes[J].Theriogenology,2000, 54(7):1109-1116.

[7] Swain JE,Bormann CL,Clark SG,etal.Use of energy substrates by various stage preimplantation pig embryo produced in vivo and in vitro[J].Reproduction,2002, 123(2):253-260.

[8] Macklon NS,Pieters MH,Hassan MA,etal.A prospective randomized comparison of sequential versus monoculture systems for in-vitro human blastocyst development[J].Hum Reprod,2002,17(10):2700-2705.

[9] Gardner DK,Lane M.Amino-acids and ammonium regulate mouse embyro development in culture[J].Biol Reprod,1993,48(2):377-385.

[10] Lane M,Gardner DK.Increase in postimplantation development of cultured mouse embryos and induction of fetal retardation and exencephaly by ammoniumions[J].Reprod Fertil,1994,102(2):305-312.

[11] Liu Z,Foote RH.Effects of amino acids on the development of IVM/IVF bovine embryos in a simple protein free medium[J].Hum Reprod,1995,10(11):2985-2991.

[12] Lane M，Gardner DK.Nonessential amino acids and glutamine decrease the time of the first three cleavage divisions and increase compaction of mouse zygotes in vitro[J].J Assist Reprod Genet，1997,14(7):398-403.

[13] 成俊萍，陸風花，王曉麗.氨基酸、維生素對水牛體外受精胚胎體外發(fā)育的影響[J].中國獸醫(yī)學報,2010,30 (2):278-281.

[14] Lane M,Hooper K,Gardner DK.Effect of essential amino acids on mouse embryo viability and ammonium production[J].Assist Reprod Genet,2001,18(9):519-525.

[15] Biggers JD,McGinnis LK,Raffin M.Amino acids and preimplantation development of mouse in protein-free potassium simplex optimized medium[J].Biol Reprod， 2000,63(1)：281-293.

[16] Thompson JG,Mitchell M,Kind KL.Embryo culture and long term consequences[J].Peprod Fertil Dev,2007,19(1):43-52.

[17] 宋雪梅,王猛,鄧星,等.胎牛血清對豬孤雌胚早期體外發(fā)育的影響[J].中國獸醫(yī)學報,2011,31(3)：425-427.

[18] 蔣建榮，凌澤繼，鄒知明，等.不同血清類型對水牛胚胎體外培養(yǎng)效果的影響[J].中國獸醫(yī)學報，2011,31(3)：433-435.

[19] 孫新明，張建平，孫弋.山羊體外受精胚胎序貫培養(yǎng)的研究[J].生物技術(shù)，2008,18(49)：49-51.

[20] 劉洋,蘇瑩,杜玲,等.胰島素對ICR小鼠胚胎體外發(fā)育的影響[J].昆明醫(yī)學報,2009,30(11):33-37.

[21] 孟麗燕,周紅林,彭信刊,等.表皮生長因子(EGF)和胰島素樣生長因子(IGF-Ⅱ)對小鼠1-細胞胚胎體外發(fā)育的影響[J].生殖與避孕,2011,31(1):1-5.

[22] 潘景,劉洋,周紅林.IGF-Ⅱ、EGF 對 ICR 小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響[J].國際生殖健康/計劃生育雜志,2011, 30(1)：42-44.

[23] 鄭云勝,侯健,陳玉琦,等.白細胞介素和干擾素γ對綿羊體外受精胚胎體外發(fā)育影響的研究[J].內(nèi)蒙古畜牧科學,2010,23(5):12-14.

[24] 李娟,蓋凌,魏斌,等.3種體細胞共培養(yǎng)體系對昆明鼠早期胚胎體外發(fā)育潛力的影響研究[J].中國計劃生育學雜志,2012,20(7):455-458.

[25] 何志全,陳偉,李三華,等.小鼠孤雌胚胎體外共培養(yǎng)體系的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(14)：8643-8645.

[26] 張彧,陳利平,梁鴻斌,等.不同來源牛體外胚胎與牛子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)體系的建立[J].中國農(nóng)學通報,2012,28(29):39-43.

[27] 莊利利,胡德寶,蔡麗娟,等.共培養(yǎng)對小鼠胚胎內(nèi)部活性氧含量影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2013,44(3):11-15.

[28] 劉軍,鄭聰穎,李長雷,等.序貫培養(yǎng)液G1/G2對山羊核移植胚胎發(fā)育和質(zhì)量的影響[J].畜牧獸醫(yī)學報,2011,42(3)：442-447.

[29] 晁賀,劉英,王樹玉,等.序貫培養(yǎng)對比序貫聯(lián)合子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)的方法對體外胚胎發(fā)育的影響[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2013,21(9):96-98.

[30] 李娟,張艷萍,張麗紅,等.冷凍胚胎經(jīng)序貫共培養(yǎng)用于建立人胚胎干細胞系[J].中國計劃生育學雜志,2013,21(5):302-305.

[31] 林曉龍,姜樺,陳彤,等.子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)聯(lián)合序貫成組培養(yǎng)對人早期冷凍時限較長的胚胎發(fā)育具有積極的支持作用[J].復旦學報：醫(yī)學版,2012,39(6):641-644.

Research Progress in Mammalian Embryos Cultured in Vitro

DINGFang1，ZHOUHong-lin2.

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,RenheHospitalofThreeGorgesUniversity,Yichang443001，China; 2.DepartmentofGynecology,the2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming650101,China)

Glucose has inhibitory effect on embryos development in cleavage stage,but it is unnecessary to add glucose in early embryos development in vitro,embryos before stage of 8-cells need non-essential amino acid,embryos of and after stage of 8-cells need all amino acids.Low concentration of essential amino acids can promote the embryonic development,while high concentration of essential amino acids inhibit embryonic development.Bovine serum albumin and other macromolecules can supply nutrition to the embryos,as well as promote cell growth,proliferation,differentiation,and eliminate the adverse effects of serum,which makes them very good protein substitutes.Many growth factors also have positive effects on embryonic development.Coculture and sequential culture can improve the status of embryonic development,although there are also some negative effects.

Mammals; Embryo; Culture in vitro

S814.8

A

1006-2084(2015)12-2166-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.020

2013-08-30

2014-11-03 編輯：伊姍